荧光分光光度计

1、荧光分光光度计FluorescenceSpectrometer国别厂家：日本岛津公司仪器型号：RF-5301PC根本原理：主要技术指标：灯源：150WXe灯单色器：闪耀式全息光栅,F2.5刻线1300条/mm波长范围：220-900nm.波长精度：土1.5nm,分辨率：1.0nm狭缝宽：1.5,3,5,10,15,20nm灵敏度：S/N比150以上带宽5nm、水拉曼峰时测定方式：荧光光谱测定、定量测定、时间过程测定软件功能：10通道显示,数据RSC转换,谱图自动找峰,不同谱图加减乘除,谱图倒数、导数、常用对数转换等.主要功能：固体和液体的激发光谱、发射光谱和同步荧光光谱；荧光物质的定量分析.使

2、用方法:1 .将荧光光度计的右侧Xe灯开关置于“ON的位置,再翻开电源开关和电脑电源.2 .双击电脑上的RF-5301PC图标,静等仪器自检完成,出现喀嚓声后,显示RF-5301P窗口.3 .预热：开机预热20分钟后才能进行测定工作.4 .新建文件夹：在Data文件夹里新建本次所做实验的子文件夹5 .启动RF-5301PC后在AcquireMode中选择欲分析的工程.6 .设定参数：根据测量方式在Configure的Parameter里设定适宜的参数.7 .置入样品：将已经装入样品的四面擦净后的石英荧光比色皿放入样品室内试样槽后,将盖子盖好.8 .扫描：参数设定完毕后,点击窗口右下角的“Sta

3、rt图标,开始才3描,扫图结束后输入文件名将文件储存.9 .保存：在“File中的“SaveChannel对曲线进行保存.10 .转换文件：在“File的“DataTranslation"里单击要转换的“ASCH格式或者“DIF格式.11 .关机：测试完毕后,关闭电脑.之后要先关闭氤灯Xe灯开关置于“Off位置,散热20分钟后,再关闭电源开关.考前须知：1 .开机时,请保证先开氤灯电源,再开主机电源.每次开机后请先确认一下排热风扇工作正常,以保证仪器正常工作,发现风扇有故障,应停机检查.2 .使用石英样品池时,应手持其棱角处,不能接触光面,用毕后,将其清洗干净.3 .当操作者错误操作

4、或其它干扰引起微机错误时,可重新启动计算机,但无须关断氤灯电源.4 .光学器件和仪器运行环境需保护清洁.切勿将比色皿放在仪器上.清洁仪器外表时,请勿使用乙醇乙醍等有机溶剂,请勿在工彳中清洁,不使用时请加防尘罩.5 .为延长氤灯的使用寿命,实验完毕后要先关闭Xe灯,不关电源主机电源光度计的右侧,等其散热完毕后再关闭电源.工作原理荧光产生的原理荧光的定义：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光.荧光产生的原理：化学物质能从外界吸收并储存能量如光能、化学能等而进入激发态,当其从激发态再回复到基态时,过剩的能量可以电磁辐射的形式放射即发光.荧光化合物的两种特征光谱1 .荧光激发

5、光谱,就是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱,它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率.2 .荧光发射光谱,如使激发光的波长和强度保持不变,而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上,扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度,然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线,所得到的谱图称为荧光光谱.物质的激发光谱和荧光发射光谱,可以用作该物质的定性分析.当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时,物质在一定浓度范围内,其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系,可以用作定量分析.荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高,浓度太大的溶液会有自熄灭作用,以

6、及由于在液面附近溶液会吸收激发光,使发射光强度下降,导致发射光强度与浓度不成正比,故荧光分析法应在低浓度溶液中进行.荧光发射的特点：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能,发光荧光现象也随之在瞬间内消失.溶液荧光光谱通常具有的特征：1斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中,所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长.2荧光发射光谱的形状与激发波长无关.3荧光发射光谱的形成与吸收光谱的形状有镜像关系荧光的猝灭：荧光分子的辐射水平在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭,这是由于激发态分子的电子不能回复到基态,所吸收的能量无法以荧光的形式发射.一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作

7、猝灭剂,以消除不需用的荧光.因此荧光物质的保存应注意预防光特别是紫外光的直接照射和与其他化合物的接触.荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光,总或多或少地以其他形式释放.荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率,与发射荧光光量子的数值成正比.荧光效率=发射荧光的光量分子数荧光强度/吸收光的光量子数激发光强度发射荧光的光量子数亦即荧光强度,除受激发光强度影响外,也与激发光的波长有关.各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱荧光光谱,即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰.选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长,且测定光波量接近于最大发射光波峰时,得到的荧光强度也

8、最大.测量原理稀溶液IF=2.303FI0ecb,其中,I0为激发光强度；If为荧光强度；.f为荧光效率；b为液池厚度；e和C分别为发光物质的摩尔吸光系数和摩尔浓度.技术指标：波长扫描范围：220-900nm波长精度：*5nm;狭缝范围：0.15-20nm信噪比：S/N比150以上水拉曼峰测定,狭缝5nm最高扫描速度：5,500nm/min操作规程1 .开机a.确认所测试样液体或固体,选择相应的附件.b.先开启仪器主机电源,预热半小时后启动电脑程序RF-530XPC,仪器自检通过后,即可正常使用.2 .测样（1） spectrum模式a.在“AcquireMode中选择"Spectr

9、um模式.对于做荧光光谱的样品,"Configure甲“Parameters的参数设置如下：“SpectrumType中选择Emission;给定EX波长;给定EM的扫描范围最大范围220nm900nm;设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度,点击“O觥成参数的设定.对于做激发光谱的样品,"Configure甲“Parameters的参数设置如下:“SpectrumType中选择Excitation;给定EM波长;给定EX的扫描范围(最大范围220nm900nm);设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度,点击“OK完成参数的设定.b.在样品池中放入待测的溶液,点击“Start,'

10、;即可开始扫描.c.扫描结束后,系统提示保存文件.可在"Presentation中选择"Graf""Radar""BothAxesCtrl+R来调整显示名果范围；在"Manipulate中选择"PeakPick来标出峰位,最后在"Channel中进行通道设定.d.述操作步骤对固体样品同样适用.(2) Quantitative模式a.在“AcquireMode中选择"Quantitative模式.b."Configured"Parameters的参数设置如下：Method选择&

11、quot;MultiPointWorkingCurve""OrderofCferVe"1s和"No"给定EX、EM波长;设定狭缝宽度,点击“OK完成参数的设定.c.在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行"AutoZero命令校零点.d.点击“Standard模式,制作工作曲线.e.将样品池中的空白溶液换成一系列的浓度的样品标准溶液进行测量,执行“Rea晞令,得到相应的荧光强度,系统根据测量值自动生成一条荧光强度-浓度曲线.f.在“Presentation中选择"DisplayEquation,得到标准方程.将此工作曲线&q

12、uot;Save"为扩展名为“.std的文件.g.工作曲线制备完毕,即可进入未知样的测量,选择进入“Unknown模式,将样品池中的浓度标准溶液换成待测样品溶液,执行"Read命令,即可得到相应的荧光强度和相应的浓度.将此"Save'为扩展名为“.qnim文件.(3) TimeCourse模式a.在“AcquireMode中选择"TimeCourse模式.b."Configured"Parameters的参数设置如下：给定EX、EM波长;设定狭缝宽度；设定反响时间；读取速度；读取点数；点击“OK,完成参数的设定.c.在样品池中

13、放入装有空白溶液的比色皿后执行"AutoZero命令校零点.d.将样品池中的空白溶液换成待测溶液,点击“Start,'即可开始扫描.扫描结束后,即可得到荧光强度对时间的工作曲线.e.将此工作曲线“Save为扩展名为“.TMC的文件.3.关机退出软件后关毕主机.考前须知a.请注意保护液体比色皿,特别是测试有机样品的同学请在测量完毕后用有机溶剂清洗,枯燥后再放入盒子中,否那么会造成比色皿外表严重污染,影响透光度.b.固体样品池仅剩一个,测试完毕请物归原处.测试完毕请注意登记,关闭仪器.分子吸收、荧光、磷光辐射跃迁无辐射跃迁一一去活化过程处于激发态分子不稳定,通过辐射或非辐射跃迁等

14、去活化过程返回至基态.这些过程包括：1振动弛豫在液相或压力足够高的气相中,处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子,从而从高振动能层失活至低振动能层的过程,称为振动弛豫.2内转换对于具有相同多重度的分子,假设较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时,那么电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁,如S2-S1;T2-T1定性分析任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱.它们是荧光定性分析的根底.1激发光谱改变激发波长,测量在最强荧光发射波长处的强度变化,以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱.激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似,经校正后二者完全相同！这是由于分子吸收光能的过程就