生物化学第二章蛋白质

1、四、肽（四、肽（peptidepeptide） 一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。 当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的-氨基和-羧基。一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组由两个氨基

2、酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。基酸残基。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键肽链写法肽链写法游离游离-氨基在左，游离氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之羧基在右，氨基酸之间用间用“-”表示肽键。表示肽键。 H2N-丝氨酸丝氨酸-亮氨酸亮氨酸-苯丙苯丙氨酸氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）a. a. 肽晶体的熔点都很高。肽晶体的熔点都

3、很高。b. b. 肽的酸碱性质主要来自游离末端肽的酸碱性质主要来自游离末端 -NH2-NH2和游离和游离末端末端 -COOH-COOH以及侧链上可解离的基团。以及侧链上可解离的基团。c. c. 每一种肽都有其相应的等电点每一种肽都有其相应的等电点. .d. d. 肽也能发生茚三酮反应、肽也能发生茚三酮反应、 SangerSanger反应、反应、DNSDNS反应和反应和EdmanEdman反应；还可发生双缩脲反应。反应；还可发生双缩脲反应。 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽（activ

4、e peptide）。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽) ) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。 五、五、 蛋白质的结构蛋白质的结构 蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformationconf

5、ormation）。在结构中，这种构象是原子）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：结构层次：一级结构（一级结构（primaryprimary）二级结构（二级结构（secondarysecondary）三级结构（三级结构（tertiarytertiary）四级结构（四级结构（quaternaryquaternary） Primary secondary tertiary quaternary1. 蛋白质的一级结构（化学结构）蛋白质的一级结构（化学结构） 一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残一级结构就是蛋白质分子中氨基

6、酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNAmRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（的共价键（covalent bondscovalent bonds）主要指肽键）主要指肽键（peptide bondpeptide bond）和二硫键（）和二硫键（disulfide disulfide bondbond） 定义定义 1969 1969年，年，国际纯化学与应用化国际纯化学与应用化学委员会（学委员会（IUPACIUPAC） 规定：蛋白质的一级规定

7、：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连结构指蛋白质多肽连中中AAAA的排列顺序，包的排列顺序，包括二硫键的位置。其括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基蛋白质生物功能的基础。础。胰胰岛岛素素的的一一级级结结构构 CONHCC肽平面2 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 二级结构的概念：二级结构的概念：多肽链在一级结构的基础多肽链在一级结构的基础上，按照一定的方式有规律的旋转或折叠形成上，按照一定的方式有规律的旋转或折叠形成的空间构象。其实质是多肽链在空间的排列方的空间构象。其实质是多肽链在空间的排列方式。式。 - -螺旋、螺旋、-折

8、叠、折叠、 -转角、自由回转转角、自由回转 -螺旋在许多蛋白中存在，如螺旋在许多蛋白中存在，如-角蛋白、血角蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等，主要由红蛋白、肌红蛋白等，主要由-螺旋结构组成。螺旋结构组成。每每3.63.6个氨基酸残基上升一圈，相当于个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm0.54nm。多个肽键平面通过多个肽键平面通过-碳原子旋转，主链绕一条固碳原子旋转，主链绕一条固定轴形成右手螺旋。定轴形成右手螺旋。相邻两圈螺旋之间借肽键中相邻两圈螺旋之间借肽键中C CO O和和N-HN-H形成许多链形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的内氢健，即每一个氨基酸残基中的NHNH和前面相隔三和前面相隔

9、三个残基的个残基的C CO O之间形成氢键，这是稳定之间形成氢键，这是稳定-螺旋的主螺旋的主要键。要键。肽链中氨基酸侧链肽链中氨基酸侧链R R，分布在螺旋外侧，其形状、，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响大小及电荷影响-螺旋的形成。螺旋的形成。 -螺旋的螺旋的结构要点结构要点 酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于荷相斥，不利于-螺旋形成；较大的螺旋形成；较大的R(R(如苯如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸) )集中的区域，也集中的区域，也妨碍妨碍螺旋形成；脯氨酸因其螺旋形成；脯氨酸因其-碳原子位碳原子位于五元环上，不易扭转

10、，加之它是亚氨基酸，于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述不易形成氢键，故不易形成上述-螺旋；甘螺旋；甘氨酸的氨酸的R R基为基为H H，空间占位很小，也会影响该处，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。螺旋的稳定。影响影响-螺旋稳定的因素螺旋稳定的因素-折叠结构（折叠结构（-pleated sheet-pleated sheet） 是一种肽链相当伸展的结构。肽链（段）按层排列，依靠相邻肽链（段）（段）上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。CCCCCCRRRRRRNNCNNCCC平行平行反平行反平

11、行多肽链呈锯齿状（或扇面状、片层状）排列成多肽链呈锯齿状（或扇面状、片层状）排列成比较伸展的结构；比较伸展的结构；相邻两个氨基酸残基的轴心距离为相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm0.35nm，侧，侧链链R R基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间有氢键相连；有氢键相连；有平行式和反平行式两种，平行式的折叠其有平行式和反平行式两种，平行式的折叠其=-119=-119。，=+113=+113。反平行折叠其。反平行折叠其=-139=-139。，=+135=+135。 这种片层在丝心蛋白里大量存在。这种片层在丝心蛋白里大量存在。-折叠结构折叠结构结要点

12、结要点-转角转角（-turn） 又称又称-弯曲，弯曲，-回折或发夹结构。指蛋白质回折或发夹结构。指蛋白质的多肽链在形成空间构象时经常会出现的多肽链在形成空间构象时经常会出现180180。的的回折，回折处的结构就称为回折，回折处的结构就称为-转角。一般由四转角。一般由四个连续的氨基酸组成，第一个氨基酸的羧基与个连续的氨基酸组成，第一个氨基酸的羧基与第四个氨基酸的氨基形成氢键。也有一些是由第四个氨基酸的氨基形成氢键。也有一些是由第一个氨基酸的羧基与第三个氨基酸的氨基形第一个氨基酸的羧基与第三个氨基酸的氨基形成氢键。成氢键。 -转角转角为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转为了紧紧折叠成紧密的球

13、蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。N1CHCC2CHNHO=C3CHNC4CHNRRHOHRROHO-转角经转角经常出现在常出现在连接反平连接反平行行-折叠折叠片的端头。片的端头。自由回转（无规则卷曲）自由回转（无规则卷曲）没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。 超二级结构超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。结构域结构域是球状蛋白质

14、的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合成三级结构。 折叠筒折叠筒结构域（结构域（structural domain）在一些相对较大的蛋白质分子中，在空间折叠时往往先分别折叠成几在一些相对较大的蛋白质分子中，在空间折叠时往往先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装成更复杂的球状结构，这种在二级或超二个相对独立的区域，再组装成更复杂的球状结构，这种在二级或超二级结构基础上形成的特定区域称为结构域。它的结构层次介于超二级级结构基础上形成的特定区域称为结构域。它的结构层次介于超二级结构和三级

15、结构之间。如图所示：结构和三级结构之间。如图所示： 一条多肽链中所有原子在三维空间的整一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。大多数蛋白质的三级结在内的空间排列。大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。在三级结构中，大构为球状或近似球状。在三级结构中，大多数的亲水的多数的亲水的R R侧基分布于球形结构的表面，侧基分布于球形结构的表面，而疏水的而疏水的R R侧基分布于球形结构的内部，形侧基分布于球形结构的内部，形成疏水的核心。成疏水的核心。 3. 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构l纤维状蛋白质通常只含有一种二级结构

16、，而球纤维状蛋白质通常只含有一种二级结构，而球状蛋白质往往含有多种二级结构；状蛋白质往往含有多种二级结构；l球状蛋白质具有明显的折叠层次：一级结构球状蛋白质具有明显的折叠层次：一级结构二级结构二级结构超二级结构、结构域超二级结构、结构域三级结构或三级结构或亚基亚基四级结构；四级结构；l球状蛋白质是紧密的球状或椭球状实体；球状蛋白质是紧密的球状或椭球状实体；l疏水性侧链埋藏于球体分子内，亲水性侧链则疏水性侧链埋藏于球体分子内，亲水性侧链则暴露于表面；暴露于表面；l球状分子的表面有一个空穴（裂沟、凹槽或口球状分子的表面有一个空穴（裂沟、凹槽或口袋），能结合配体，是蛋白质的活性部位；袋），能结合配体

17、，是蛋白质的活性部位；l由二级结构向三级结构转变的主要力量是疏水由二级结构向三级结构转变的主要力量是疏水作用。作用。4 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链链( (亚基亚基) )，彼此借次级键相连，形成一定的空，彼此借次级键相连，形成一定的空间结构，称为四级结构。间结构，称为四级结构。 具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基或亚单位基或亚单位(subunit)(subunit)，亚基可以相同，亦可以，亚基可以相同，亦可以不同。四级结构的实质是亚基在空间排列的方不同。四级结构的实质是亚

18、基在空间排列的方式式. . 单独亚基，无生物学功能，当亚基聚合成单独亚基，无生物学功能，当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后，才有功能。为具有完整四级结构的蛋白质后，才有功能。 肽键肽键共价键共价键次级键次级键化学键化学键一级结构一级结构氢键氢键二硫键二硫键二、三、四级结构二、三、四级结构疏水键疏水键盐键盐键范德华力范德华力三、四级结构三、四级结构5 蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子中的共价键与次级键其中二硫键和疏水作用最主要其中二硫键和疏水作用最主要 维持三级结构的作用力维持三级结构的作用力 氢键氢键 氢键氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一的形成常见于连接在一电

19、负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。原子之间。 氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。重要的作用。 氢键的键能较低氢键的键能较低(12kJ/mol)，因而，因而易被破坏。易被破坏。氢氢键键的的形形成成:v非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。水作用力。v蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在

20、水中也可相互聚集，性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。等的侧链基团。 范德华氏（范德华氏（van der Waals)van der Waals)引力引力分子之间存在的相互作用力分子之间存在的相互作用力v离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。离子键的形成离子键的形成六、蛋白质分子结构与功能的关系六、蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质分子具有多

21、样的生物学功能，需蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。构象。各种蛋白质都有特定的空间构象，而特各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。统一的。一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础 RNase是由124氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4个二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂（如8mol/L的尿素）和一些还原剂（如巯基乙醇）存在下，酶分

22、子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。2. 2. 前体与活性蛋白质一级结构的关系前体与活性蛋白质一级结构的关系 由由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原个氨基酸残基构成的前胰岛素原(pre-proinsulin），在合成的时候完全没有活性，），在合成的时候完全没有活性，当切去当切去N-端的端的24个氨基酸信号肽，形

23、成个氨基酸信号肽，形成84个个氨基酸的胰岛素原（氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素素(胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活)。3 3 蛋白质的一级结构与分子病蛋白质的一级结构与分子病 现知几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变有关，都称之为分子病。例如镰刀型贫血症，它是由于血红蛋白的-亚基上的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸，导致血红蛋白的结构和功能的改变，其运输氧气的能力大大地降低，并且红细胞呈镰刀状。 镰状细胞贫血

24、（镰状细胞贫血（sick-cell anemiasick-cell anemia）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。-链 1 2 3 4 5 6 7Hb-A N- Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-LysHb-S N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-LysHbHb由由4 4条肽链组条肽链组成：成：22、22，功能是运载功能是运载O O2 2 。在去氧在去氧HbHb亚基中亚基中有下列几对离子有下列几对离子键：键：1 蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的两性电离及等电点蛋白质是两性电解质 在蛋白质分子中，由许多可解离的基团，如末端的氨基、羧基及侧链的咪唑基、胍

25、基、巯基及羟基，也能向酸碱一样解离，因此，蛋白质是多价的两性电解质。蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。等电点的定义 当溶液在某一特定的pH时，蛋白质以两性离子的形式存在，正负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向任何一方移动。此时，溶液的pH称为该蛋白质的等电点。七、蛋白质的性质七、蛋白质的性质等电点的性质： pI与分子中的酸碱性氨基酸的比例有关。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，其它性质如粘度、渗透压及膨胀性等也都是最小。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。l影响泳动速度的因素：l

26、A、电荷多少、电荷多少 lB、分子大小、分子大小 lC、电场强度、电场强度2 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质由于蛋白质的分子量很大（1-100nm），它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因蛋白质溶液稳定的原因表面形成水膜（水化层）；带相同电荷。胶体性质胶体性质3 蛋白质

27、的沉淀反应蛋白质的沉淀反应定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。沉淀试剂:加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。加重金属盐加生物碱试剂(单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂)4 蛋白质的变性蛋白质的变性定义: 天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原

28、有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性(denaturation) 。实质:次级键断裂，空间结构破坏。(变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固) 蛋白质变性后的表现 生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。物理因素： 高温、高压、震荡、紫外线、电离辐射、 超声波等。化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。蛋白质变性的利用：医疗方面；食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等。 (有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定

29、限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质)反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有此反应的有此反应的蛋白质或氨蛋白质或氨基酸基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫 色 或 粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应H g N O3、H g ( N O3)2及HNO3混合物红色 Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄 色 、 橘色 Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色 Trp坂口反应(Sakaguchi反应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三

30、酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基-氨基酸 5 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应OHN6 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。7 蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力等。 蛋白质纯化的目标: 增加制品的纯度，即设法除去变性的和不需要的蛋白质以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。

31、分离纯化蛋白质的程序为：前处理（细胞或组织处理）、粗分级分离（除去杂蛋白）和细分级分离。分子大小分子大小透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。盐溶和盐析：盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶

32、。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。温度沉淀：温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在040，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。溶解度溶解度电电荷荷电泳（净电荷、分子大小、形状）区带电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）毛细管电泳离子交换层析：是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤