病理学方法学2013年研究生

1、激光共聚焦显微镜技术激光共聚焦显微镜技术(Confocal laser scanning microscope, CLSM)激光扫描共聚焦显微镜成像原理激光扫描共聚焦显微镜成像原理 激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转射镜使光束偏转9090度，经过物镜会聚在物镜的焦度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通

2、分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。再通过焦点处的针孔，由检测器接收。标准盖玻片厚度为标准盖玻片厚度为0.17mm载玻片厚度是载玻片厚度是1.1mm载物台与物镜之间的工作距离有限载物台与物镜之间的工作距离有限清晰度高清晰度高物镜最大放大倍数物镜最大放大倍数150X主要用于切片的观察主要用于切片的观察正置激光共聚焦显微镜正置激光共聚焦显微镜物镜、聚光镜、光源的位置颠倒物镜、聚光镜、光源的位置颠倒长工作距离物镜和聚光镜长工作距离物镜和聚光镜透射光源和载物台之间空间更宽敞透射光源和载物台之间空间更宽敞清晰度略低于

3、正置清晰度略低于正置物镜最大放大率为物镜最大放大率为60X多用于无色透明的活体观察，如组多用于无色透明的活体观察，如组织培养、细胞离体培养、浮游生物、织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验环境保护、食品检验倒置激光共聚焦显微镜倒置激光共聚焦显微镜工作原理工作原理计算机系统计算机系统激光照射系统激光照射系统显微镜系统显微镜系统检测系统检测系统X-Y平台系统平台系统Z-轴步进马达轴步进马达激光共聚焦显微镜发展史激光共聚焦显微镜发展史早在早在1957年就已提出，年就已提出，二十年后由二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度在高数值孔径透镜装置上改装成功具

4、有高清晰度的共聚焦显微镜，的共聚焦显微镜，1985年年Wijnaendts Van Resandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，镜在生物学中应用的文章，1. 1987年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。由于由于pinhole的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT探测器探测到，从探测器探测到，从而提高了成像效果。而提高了成像效果。通过对样品在通过对样品在X-Y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。如果调节焦平面在方向上

5、的逐点扫描，可以形成二维图像。如果调节焦平面在Z线的线的位置，连续扫描多个不同位置，连续扫描多个不同Z位置的二维图像，则可以形成一个位置的二维图像，则可以形成一个3D图像，图像，3D的重建需的重建需要软件的支持。要软件的支持。普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的微镜采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮

6、廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的焦平面以外的点被挡在

7、探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。个焦平面上清晰的共聚焦图像。 激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片3.增加侧向分辨率4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜

8、的区别普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别普通的荧光显微镜普通的荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜*激光共聚焦显微镜的性能特点激光共聚焦显微镜的性能特点1.分辨率高分辨率高 最小观察厚度是最小观察厚度是0.5m， 分辨率是普通光学显微镜的分辨率是普通光学显微镜的1.4倍倍2. 灵敏度高灵敏度高 利用利用PMT检测荧光检测荧光3. 扫描速度快扫描速度快 毫秒级和微妙级毫秒级和微妙级4. 扫描范围大扫描范围大 最大可达最大可达2cmX2cm5. 图像存取方便图像存取方便6. 可进行光切片的观察可进行光切片的观察 三维图像分析三维图像分析7. 可进行荧光定量分析可进行荧光定量分析激光共聚焦

9、显微镜的应用激光共聚焦显微镜的应用 定量荧光测量定量荧光测量 进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。 单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关

10、监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。抗原表达的准确定位及定量信息。1. 定量共聚焦图像分析定量共聚焦图像分析借助于激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度借助于激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如光学切

11、片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、含量、RNA含量、分子扩散、含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。析。3. 三维重组分析生物结构三维重组分析生物结构组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。4. 动态荧光测定动态荧光测定Ca2+ 、pH 及其它细胞内离子测定，能迅速对样品的点，线及其它细胞内离子测定

12、，能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针及使用双荧光探针Fluo-3和和CNARF进行进行Ca2+和和pH的同时测定。的同时测定。5. 荧光光漂白恢复

13、（荧光光漂白恢复（FRAP）-活细胞的动力学参数活细胞的动力学参数荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过激光共聚焦显微镜可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而通过激光共聚焦显微镜可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。揭示细胞结构及相关的机制。6.

14、胞间通讯研究胞间通讯研究动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+ ,PH和和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。水平对缝隙连接的调节作用。7. 细胞膜流动性测定细胞膜流动性测定A

15、CAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。方面有

16、重要作用。8. 笼锁笼锁解笼锁测定解笼锁测定许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其

17、它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。功能的时间和空间作用。9. 粘附细胞分选粘附细胞分选ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是法，它是Meidian公司专利技术，首先将公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因

18、在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。方法特别适于对数量较多细胞的选择。VWFCD31CD31 VWFVWF expressed in big vess

19、el.CD31 expressed in endothelial cell of capillary and big vessel.VWFCD34VWF CD34WKY 40X2SHR-SP 40X2GFAP and lectin double stainingGFAP lectinGFAP lectinGFAP lectinpAs we know, astrocytes composed the BBB.pAfter stroke, number of it becomes more and processes of it connected with BBB more closely th

20、an before.GFAPAstrocyte lectinVessleNG2 and lectin in double staining 3D3D3DNG2 lectin TOTO3A Mouse ModelRed, CD45; Green, Desmin and Blue, DAPI 流式细胞仪流式细胞仪 （Flow Cytometry,FCM)原理及应用原理及应用1 1、流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2

21、、流式细胞术、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分个）的定量分析和分选（纯度可达析和分选（纯度可达99%以上）的技术。以上）的技术。3.流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：测量速度快，测量速度快，最快可在最快可在1秒种内计测数万个细胞；秒

22、种内计测数万个细胞；可进行多参数测量，可以对同可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；既既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。是细胞分析技术，又是精确的分选技术。基本概念基本概念流式细胞术发展简史流式细胞术发展简史 1.1934年，年，Moldavan首次提出了使悬

23、浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数。在亮视野下用显微镜进行计数。2.1953年年Crosland Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在

24、作层液。这就奠定了现代线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。流式细胞术中的液流技术基础。 3.1956年，年，Coulter在多年研究的基础上利用在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了效应生产了Coulter 计数计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和

25、数目方面的信息。的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。4.1967年年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。计数的装置。5.1973年年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主计数技术的主要历程。要历程。流式细胞仪结构流式细胞仪结构 激光光源及光束形成系统激光光源及光束形成系统 流动室及液

26、流驱动系统流动室及液流驱动系统 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。收集不同波长的荧光信号。 信号检测与分析：光电倍增管（信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放 大。大。 存储、显示、分析系统：计算机。存储、显示、分析系统：计算机。 细胞分选系统细胞分选系统EPICS XL 流式细胞分析仪流式细胞分析仪* * *工作原理工作原理 在一定的压力下，鞘液带着细胞或是微粒通过喷嘴中心在一定的压力下，鞘液带着细胞或是微粒通过喷嘴中心进入到流式照

27、射室，在流式照射室的分析点，激光照射到进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射到细胞发生散射和折射，发射出散射光；同时，细胞所携带细胞发生散射和折射，发射出散射光；同时，细胞所携带的荧光素被激光激发并发射出荧光。前向散射光（的荧光素被激光激发并发射出荧光。前向散射光（FSC)FSC)和和侧向散射光（侧向散射光（SSC)SSC)检测器把散射光转换成电信号，荧光则检测器把散射光转换成电信号，荧光则被激光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的被激光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增器，把荧光转换成电信号。散射光信号和荧光信光电倍增器，把荧光转换成电信号。散射光信号和荧

28、光信号经过放大后，再经数据化处理输入电脑并储存，根据细号经过放大后，再经数据化处理输入电脑并储存，根据细胞的散射光和荧光进行分析或分选。胞的散射光和荧光进行分析或分选。Flow CellInjector TipSheath fluid 液体在高压下形成一个圆柱形的液流，样品从液流的中心流入，液体就像一个鞘液体在高压下形成一个圆柱形的液流，样品从液流的中心流入，液体就像一个鞘一样包在样品的外面。流动的鞘液和流动的细胞在喷嘴处汇合，并且在喷嘴处被加一样包在样品的外面。流动的鞘液和流动的细胞在喷嘴处汇合，并且在喷嘴处被加速，使细胞精确列队依次通过激光束。在喷嘴处细胞进入鞘液并且一直保持在中心速，使细

29、胞精确列队依次通过激光束。在喷嘴处细胞进入鞘液并且一直保持在中心位置，这个技术被称为流体动力聚焦。流体动力聚焦使细胞限制并保持在液流的中位置，这个技术被称为流体动力聚焦。流体动力聚焦使细胞限制并保持在液流的中心。样品在液流中心的流动称之为轴流。心。样品在液流中心的流动称之为轴流。Forward Angle Light Scatter前向散射光（前向散射光（FSC)FALS SensorLaser透镜安装在分析点周围，用于收集细胞被照射时出现的光信号，信号传透镜安装在分析点周围，用于收集细胞被照射时出现的光信号，信号传想光电二极管或光电倍增器，光电管再把接收的信号转换成电脉冲，电想光电二极管或光

30、电倍增器，光电管再把接收的信号转换成电脉冲，电脉冲的强度与光强度成正比。脉冲的强度与光强度成正比。FSC反映细胞的大小与体积反映细胞的大小与体积。前向散射角传感器 90 Degree Light Scatter（side scatter,SSC)直角光散射（侧向散射光）直角光散射（侧向散射光）FALS Sensor90LS SensorLaser 在照射点的侧向（在照射点的侧向（90度）有一个光电二极管接收细胞散射的光信号，细胞表面度）有一个光电二极管接收细胞散射的光信号，细胞表面越粗糙、越不规则或内部的颗粒越多，散射到侧向的光信号越大。越粗糙、越不规则或内部的颗粒越多，散射到侧向的光信号越大

31、。SSC的强度与细的强度与细胞的表面结构和内部结构及其大小和形状有关，也成为粒度信号或直角光散射信号。胞的表面结构和内部结构及其大小和形状有关，也成为粒度信号或直角光散射信号。侧向散射角传感器侧向散射角传感器LaserFluorescence Detectors（荧光检测器）（荧光检测器）FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.) 光电倍增管（光电倍增管（PMT)可以用来检测从细胞发出的不同颜色的荧光信号。可以用来检测从细胞发出的不同颜色的荧光信号。细胞荧光包括自身的荧光和荧光素发出的不同颜色的荧光信号。细

32、胞荧光包括自身的荧光和荧光素发出的不同颜色的荧光信号。PMT只接只接收一定波长的荧光，为了收一定波长的荧光，为了PMT只检测一个波长的光，一般在只检测一个波长的光，一般在PMT之前安装之前安装双色反光镜和不同颜色的滤光片。双色反光镜和不同颜色的滤光片。Standard Band Pass Filter（带通滤波器）（带通滤波器）Transmitted LightWhite Light Source630 nm BandPass Filter620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 deg（双色反光镜）直角形信号检测系统（双色反光镜）直角形信号检

33、测系统Reflected lightTransmitted LightLight Source双色反光镜是通过反射一定波长范围的光，透过其余光来实现分离作用的。双色反光镜是通过反射一定波长范围的光，透过其余光来实现分离作用的。短通反光镜短通反光镜-605nm短通反光镜（短通反光镜（605DSP)允许短于允许短于605nm的光透过，长于的被反射。的光透过，长于的被反射。长通反光镜长通反光镜- 605nm长通反光镜（长通反光镜（605DLP)允许长于允许长于605nm的光透过，短于的被反射的光透过，短于的被反射 流式细胞术常用荧光素流式细胞术常用荧光素 流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种流式细胞仪

34、测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同，激发他们分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管,它的发射光波它的发射光波488nm,氦氖离子气体激光管发射光波长氦氖离子气体激光管发射光波长633nm）。）。488nm激光光源常用的荧激光光源常用的荧光染料有光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、（藻红蛋白）、PI（碘化丙（碘化丙啶）、啶）、CY5（化青素）、（化青素）、preCP(叶

35、绿素蛋白叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白藻红蛋白-得克萨得克萨斯红斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是：等。他们的激发光和发射光波长分别是： 激发光波长（激发光波长（ nm） 发射光峰值（发射光峰值（ nm） FITC 488 525（绿）（绿） PE 488 575（橙红）（橙红） PI 488 630（橙红）（橙红） ECD 488 610（红）（红） CY5 488 675（深红）（深红） PreCP 488 675（深红）（深红）FL3(PE-TX Red)FL5(PE-Cy7)FL2(PE)FL1(FITC)SSCFL4(PE-Cy5)630/30488/10670/30740LP

36、530/40580/30通道通道1荧光和荧光和SSC650DSP718DSP605DSP555DLP505DSP直角形信号检测系统直角形信号检测系统示意图示意图510550nm带通滤光片带通滤光片565595nm长通滤光片长通滤光片740nm665685nm605650nm 525 575FCM的主要测定指标的主要测定指标 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)其中：其中：FSC：反映细胞的大小：反映细胞的大小SSC：反映细胞内颗粒性：反映细胞内颗粒性外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图FCM标记方法标记方法单标：单标：一种单抗一种单抗/tube: FL

37、1, FSC, SSC（三参数）（三参数）双标：双标：（两种单抗（两种单抗/tube）：）：FL1, FL2, FSC, SSC（四（四参数）参数）三三/四标：四标：（三种单抗（三种单抗/tube）（四种单抗）（四种单抗/tube）：）：FL1-FL3/4, FSC, SSCq PE最强，适用于弱表达抗原最强，适用于弱表达抗原q FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广q biotin-avidin不适合弱抗原的检测不适合弱抗原的检测抗体的选择抗体的选择 散点图 密度图二维等高图直方图图图 报告中常见的几种流式细胞图报告中常见的几种流式细胞图Dot pl

38、ot细胞分选细胞分选1. 1. 液滴形成液滴形成液滴沿着一个轴振动，液流会断开形成液滴液滴沿着一个轴振动，液流会断开形成液滴2. 2. 延迟时间延迟时间 当细胞从振动的喷嘴流出到分析点时被激光照射，同时被检当细胞从振动的喷嘴流出到分析点时被激光照射，同时被检测器检测。在分析点下方，液流流出一定的距离才开始断开形成单个的液滴，测器检测。在分析点下方，液流流出一定的距离才开始断开形成单个的液滴，细胞包含在某些液滴的内部。流式细胞仪在液滴的断点对含有目标细胞的液滴细胞包含在某些液滴的内部。流式细胞仪在液滴的断点对含有目标细胞的液滴充电。分析点和充电点不在同一时间，存在时间差，这就是延迟时间。充电。分

39、析点和充电点不在同一时间，存在时间差，这就是延迟时间。流式分选的重要技巧是只给含有目标细胞的液滴进行充电。流式分选的重要技巧是只给含有目标细胞的液滴进行充电。3. 3. 液滴充电和偏转液滴充电和偏转在液滴的断点处，对含有目标细胞的液滴进行充电，使其带上正或负电荷，在在液滴的断点处，对含有目标细胞的液滴进行充电，使其带上正或负电荷，在液流的两侧放置偏转电极板，不同正负电荷的液滴分别偏向两侧，最后落到收液流的两侧放置偏转电极板，不同正负电荷的液滴分别偏向两侧，最后落到收集容器中。现在可以四路的分选。集容器中。现在可以四路的分选。4.4.液滴的收集液滴的收集488 nm laser+-Fluores

40、cence Activated Cell Sorting(细胞分选）细胞分选）Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector+85v+190v- 85v- 190v废废 液液流式细胞术的科研应用流式细胞术的科研应用 分析群体细胞分析群体细胞 所需时间短所需时间短 多参数分析多参数分析 定性或定量定性或定量流式应用常见范围流式应用常见范围 细胞大小细胞大小 细胞的颗粒度细胞的颗粒度 细胞表面分子：细胞表面分子：CD 系列系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞

41、核内分子：细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡细胞功能检测：细胞周期、凋亡流式细胞仪标本的制备流式细胞仪标本的制备一、新鲜实体瘤单细胞悬液的制备一、新鲜实体瘤单细胞悬液的制备（一）酶消化法（一）酶消化法（二）机械法：（二）机械法：剪碎法、网搓法、研磨法剪碎法、网搓法、研磨法（三）化学法：（三）化学法：作用原理除去细胞之间起到粘连的镁离子和作用原理除去细胞之间起到粘连的镁离子和钙离子，而使细胞分散开来一般用钙离子，而使细胞分散开来一般用EDTA胰酶消化液。胰酶消化液。（四）低渗法（四）低渗法利用低渗的原理使细胞膜破裂，细胞核逸出称为分散的单细利用低渗的原理使细胞膜破裂，细胞核逸出称

42、为分散的单细胞核的悬液。该法适用于由新鲜的实体瘤组织直接脱核做核胞核的悬液。该法适用于由新鲜的实体瘤组织直接脱核做核酸染色、酸染色、DNA倍体和细胞周期分析。避免脱核时间过长而并倍体和细胞周期分析。避免脱核时间过长而并没有用乙醇固定，则易造成核膨胀或破裂。没有用乙醇固定，则易造成核膨胀或破裂。（一）酶消化法（一）酶消化法 0.5% pH 1.5胃蛋白酶、胃蛋白酶、0.25% 胰蛋白酶、胰蛋白酶、0.05%胶原酶胶原酶 主要是水解组织间的胶原纤维和多糖物质、分开细胞间主要是水解组织间的胶原纤维和多糖物质、分开细胞间的紧密连接。的紧密连接。1. 切除的组织应马上放入预冷的组织培养液或生理盐水中，切

43、除的组织应马上放入预冷的组织培养液或生理盐水中，清洗血迹及其他污染物清洗血迹及其他污染物2. 除去的组织块上的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等组织除去的组织块上的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等组织3. 将组织块剪成约将组织块剪成约1cm大小的小块，用冷的生理盐水洗去剪大小的小块，用冷的生理盐水洗去剪碎的细胞碎片碎的细胞碎片4. 一般来说取一般来说取1.0g组织加入适当的酶消化液组织加入适当的酶消化液10ml5. 37的恒温水箱消化的恒温水箱消化20-30min，消化期间要振荡或吹打，消化期间要振荡或吹打 用冷的培养液终止消化，收集单细胞悬液用冷的培养液终止消化，收集单细胞悬液 先后用先后用200

44、目和目和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，收集细胞并计数、收集细胞一般不小于收集细胞并计数、收集细胞一般不小于106细胞用乙醇固定，留用。细胞用乙醇固定，留用。（二）机械法：剪碎法、网搓法、研磨法（二）机械法：剪碎法、网搓法、研磨法 使细胞由紧密联结的组织中释放出来，这种使细胞由紧密联结的组织中释放出来，这种方法的缺点是对细胞的损伤比较大，导致细胞碎方法的缺点是对细胞的损伤比较大，导致细胞碎片多和细胞团块多，影响流式细胞仪的测试的准片多和细胞团块多，影响流式细胞仪的测试的准确性和精密度，当样本中的细胞碎片超过确性和精密度，当样本中的细胞碎片超过20%时时

45、测试的误差就很大。测试的误差就很大。（三）化学法（三）化学法 作用原理除去细胞之间起到粘连的镁离子和钙离作用原理除去细胞之间起到粘连的镁离子和钙离子，而使细胞分散开来一般用子，而使细胞分散开来一般用EDTA胰酶消化液。胰酶消化液。1.将组织剪成小块放入试管将组织剪成小块放入试管2.先加入先加入EDTA液液5ml，室温下半个小时弃去。，室温下半个小时弃去。3.加入加入EDTA胰酶消化液胰酶消化液510ml，37水浴中水浴中 30min，间断振荡，间断振荡3-5次次4.加入加入350目尼龙网进行过滤，离心沉淀目尼龙网进行过滤，离心沉淀1000rpm，5min，生理盐水冲洗，生理盐水冲洗2-3次，离

46、心次，离心800rpm5-8min。5.收集细胞悬液再离心弃上清，管底细胞打匀吸入吸收集细胞悬液再离心弃上清，管底细胞打匀吸入吸 管内，总体积管内，总体积0.1-0.2ml，用，用70%乙醇进行固定，乙醇进行固定， 放置放置4冰箱待检。冰箱待检。二、新鲜实体瘤单细胞核悬液的制备二、新鲜实体瘤单细胞核悬液的制备：用用于细胞核内的成分分析，特别是做于细胞核内的成分分析，特别是做DNA定量核定量核细胞周期检测时测定方便实用。细胞周期检测时测定方便实用。三、石蜡包埋组织单细胞悬液的制备三、石蜡包埋组织单细胞悬液的制备可用于既往实验材料的回顾性研究可用于既往实验材料的回顾性研究原理：将石蜡包埋组织经二甲

47、苯脱蜡，采用梯度原理：将石蜡包埋组织经二甲苯脱蜡，采用梯度酒精到水，使组织逐渐分级水化，使组织恢复到酒精到水，使组织逐渐分级水化，使组织恢复到甲醛固定前的状态，应用相应的酶消化液、解聚甲醛固定前的状态，应用相应的酶消化液、解聚组织细胞间的联结物并使细胞从组织片中释放而组织细胞间的联结物并使细胞从组织片中释放而制成单细胞悬液。制成单细胞悬液。四、其他单细胞悬液的制备四、其他单细胞悬液的制备（一）血单细胞悬液的制备（一）血单细胞悬液的制备用淋巴细胞分离液分离血中的单个核细胞。用淋巴细胞分离液分离血中的单个核细胞。（二）细胞培养液中的单细胞悬液的制备（二）细胞培养液中的单细胞悬液的制备 EDTA胰酶

48、进行消化胰酶进行消化（三）胸腹水标本单细胞悬液的制备（三）胸腹水标本单细胞悬液的制备离心洗涤，如果胸腹水中蛋白浓度过高的话，加入肝素抗凝。离心洗涤，如果胸腹水中蛋白浓度过高的话，加入肝素抗凝。（四）膀胱灌洗液单细胞悬液的制备（四）膀胱灌洗液单细胞悬液的制备膀胱癌细胞，不从尿液中收集，尿液中细胞容易死亡和变性。膀胱癌细胞，不从尿液中收集，尿液中细胞容易死亡和变性。（五）细针穿刺物单细胞悬液的制备（五）细针穿刺物单细胞悬液的制备 与新鲜实体瘤组织细胞制备相同与新鲜实体瘤组织细胞制备相同（六）脱落细胞样品中单细胞悬液的制备（六）脱落细胞样品中单细胞悬液的制备 食道拉网法，胃镜。支气管镜食道拉网法，胃

49、镜。支气管镜流式细胞仪的应用（一）流式细胞仪的应用（一）细胞生物学：细胞生物学：细胞凋亡研究细胞凋亡研究；定量定量分析细胞周期并分选分析细胞周期并分选不同不同细胞周期细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如时相的细胞；分析生物大分子如DNADNA、RNARNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化行染色体核型分析，并可纯化X X或或Y Y染色体。染色体。肿瘤学：肿瘤学：DNADNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用指标。近年来已应用DNADNA倍体测定技

50、术，对白血病、淋巴倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。免疫学：免疫学：研究细胞周期或研究细胞周期或DNADNA倍体与细胞表面受体及抗倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。器官移植后的免疫学监测等。流式细胞仪的应用（二）

51、流式细胞仪的应用（二）血液学：血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用等；用NBT及及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗或抗D抗原阳抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红检测血液中

52、循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。斑狼疮等。药物学：药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测测DNA凋亡峰，凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等凋亡调节蛋白等 细胞荧光染色定量技术细胞荧光染色定量技术一、细胞内抗原定量技术一、细胞内抗原定量技术（一）（一）原理原理 二抗上带有荧光标记。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，二抗上带有荧光标记。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原决定簇的数量

53、可以计算出每个细胞抗原决定簇的数量（二）（二）方法方法1.首先设立标准化的荧光素标记抗体首先设立标准化的荧光素标记抗体2.设定好流式的各种参数，保持不变设定好流式的各种参数，保持不变3.测定标准化的荧光素的强度，做出荧光分子数与荧光强度之间的标准曲线测定标准化的荧光素的强度，做出荧光分子数与荧光强度之间的标准曲线4.测定待测细胞上的荧光强度测定待测细胞上的荧光强度5.根据荧光强度计算出每个细胞的荧光素的分子数。根据荧光强度计算出每个细胞的荧光素的分子数。流式细胞流式细胞仪应用举仪应用举例例1（三）（三）测定的意义测定的意义1.PCNA及及Ki67核抗原的测定核抗原的测定2.C-erb-2抗凋亡

54、基因测定抗凋亡基因测定3.Myc基因家族基因家族4.P535.检测特征性的标记物检测特征性的标记物6.测定细胞内巨细胞病毒测定细胞内巨细胞病毒二二. DNA定量技术定量技术（一）（一）DNA定量方法定量方法1.DNA荧光染料定量法荧光染料定量法根据荧光染料如根据荧光染料如PI、EB等对细胞核等对细胞核DNA的亲和能力，使其染色，用流式细胞仪分析的亲和能力，使其染色，用流式细胞仪分析细胞中细胞中DNA的含量。与的含量。与DNA结合的荧光染料越多，荧光强度愈强。结合的荧光染料越多，荧光强度愈强。DNA含量增多证含量增多证实有肿瘤细胞出现。如果发现异倍体细胞即为恶性肿瘤实有肿瘤细胞出现。如果发现异倍

55、体细胞即为恶性肿瘤2.溴化乙啶嘧啶核苷定量法溴化乙啶嘧啶核苷定量法3.吖啶橙定量法吖啶橙定量法（二）对临床肿瘤的指导意义（二）对临床肿瘤的指导意义 软组织肿瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和软组织肿瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。宫颈癌。（三）对癌前病变（三）对癌前病变DNA倍体分析倍体分析 细胞不典型增生的程度愈明显，则细胞不典型增生的程度愈明显，则DNA异倍体出现率也增高。异倍体出现率也增高。（四）在肿瘤治疗中的作用（四）在肿瘤治疗中的作用 肿瘤存在异质性，同一种肿瘤细胞对同一化疗药物也可能存在不同程度的反应。肿瘤存在异质性

56、，同一种肿瘤细胞对同一化疗药物也可能存在不同程度的反应。通过对通过对DNA含量、含量、S期比率分析，有助于对化疗药物的选择或放射线有效照射量及期比率分析，有助于对化疗药物的选择或放射线有效照射量及时间的决定。时间的决定。*细胞凋亡检测技术细胞凋亡检测技术检测凋亡的方法检测凋亡的方法（一）形态学检测（一）形态学检测 FS,SS,反映了细胞体积缩小，胞核和细胞质结构反映了细胞体积缩小，胞核和细胞质结构变化，但是不可以对凋亡细胞进行定量。变化，但是不可以对凋亡细胞进行定量。流式细胞流式细胞仪应用举仪应用举例例2（二）根据细胞膜通透性的染色法（二）根据细胞膜通透性的染色法 凋亡细胞膜透性有一定程度的增

57、加，染料凋亡细胞膜透性有一定程度的增加，染料Hoechst 33342透性增加，透性增加，PI透性不增加可以用来区分活细胞、凋透性不增加可以用来区分活细胞、凋亡细胞和死细胞。亡细胞和死细胞。Hoechst 33342/PI 双染色法：低蓝色双染色法：低蓝色/低红光低红光 正常细胞正常细胞 高蓝光高蓝光/低红光低红光 凋亡细胞凋亡细胞 低蓝光低蓝光/高红光高红光 死亡细胞死亡细胞（三）凋亡细胞的（三）凋亡细胞的TUNEL和和ISNT法法1.直接标记法直接标记法DNA断点测定：断点测定：3羟基末端，羟基末端，DNA聚合酶聚合酶-1催催化的原位缺口转移法，缺口标记的是生物素化化的原位缺口转移法，缺口

58、标记的是生物素化的脱氧三磷酸尿苷或地高辛配体脱氧三磷酸尿的脱氧三磷酸尿苷或地高辛配体脱氧三磷酸尿苷；后者标记的为苷；后者标记的为FITC-dUTP.2.间接标记法、用链霉素亲和素间接标记法、用链霉素亲和素-FITC或抗地或抗地高辛高辛-FITC，使其灵敏度高。，使其灵敏度高。 无法区分死细胞。无法区分死细胞。流式流式“TUNEL”脱氧核苷酸转移酶催化脱氧核苷酸转移酶催化FITC-dUTP和和3OH末端末端结合，结合，DNA破裂的断端被破裂的断端被FITC-dUTP结合。结合。（四）用荧光染料对降解的（四）用荧光染料对降解的DNA进行测定进行测定 细胞凋亡后，细胞凋亡后，DNA断裂，断裂，DNA

59、断裂生成的小片段断裂生成的小片段易于释放到细胞外，导致细胞内的易于释放到细胞外，导致细胞内的DNA含量减少。用含量减少。用亲亲DNA的染料的染料PI对固定后的细胞进行染色，经流式细对固定后的细胞进行染色，经流式细胞仪分析凋亡细胞位于正常细胞的胞仪分析凋亡细胞位于正常细胞的G0/G1期峰之前出期峰之前出现凋亡细胞峰。不能检测早期凋亡细胞。现凋亡细胞峰。不能检测早期凋亡细胞。细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks - PI staining（五）（五）FITC-AnnexinV / PI双染色法双染色法 细胞凋亡早期是膜表面的磷脂酰丝氨酸（细胞

60、凋亡早期是膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS)从细胞膜内转移到膜外，因此细从细胞膜内转移到膜外，因此细胞膜上磷脂分布的不对称性被破坏而使胞膜上磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在膜外。暴露在膜外。AnnexinV是一种钙离子是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，易与依赖的磷脂结合蛋白，易与PS结合，由此充当了检测结合，由此充当了检测PS的探针。的探针。 R1File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03QuadEvents% Gated X MeanY MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.4