解毒通络调肝散对胰岛素抵抗大鼠肝脏NF

1、解毒通络调肝散对胰岛素抵抗大鼠肝脏NF kB及MCP 1表达的影响(一)【摘要】目的观察解毒通络调肝散对糖尿病(DM)胰岛素抵抗(IR)模型大鼠肝脏中核因子(NF) kB及单核细胞趋化蛋白(MCP) 1表达的影响。方法采用高脂饮食加链脲佐菌素(STZ)诱导 DMIR 大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、吡咯列酮组和解毒 通络调肝组。给药 8w 后进行各指标检测。结果解毒通络调肝散能升高 DMIR 大鼠胰岛素敏 感性指数，降低大鼠肝脏中NF kB蛋白、MCP 1蛋白表达。结论解毒通络调肝散对大鼠IR有显著改善作用，其机制可能与其减少 DM大鼠肝组织中NF kB MCP 1表达，

2、发挥抑 制肝内炎症的作用。【关键词】胰岛素抵抗(IR)；解毒通络调肝散 核因子(NF) k B单核细胞趋化蛋白(MCP) 1【Abstract 】ObjectiveToinvestigatetheeffectofJieDuTongLuoTiaoGanSan(JDTLTGS)onnuclearfactor(NF) k Ban dmonocytechemoattractantprotein(MCP)1ofliverininsulinresistant(IR)rats.MethodsIRmodelratsinducedbyhighfatandglucosefoodandSTZwererandomly

3、dividedintomodel ， metformin ， pioglitazone，andJDTLTGSgroups.After8weeks，thevariousindexeswereobserved.ResultsInsulinsensitivityindexwassignificantlyelevated，besidesNF k BandMCP 1ofliverwerereducedintheJDTLTGSgroup.ConclusionsJDTLTGScouldatte nuateIRinrats，itspharmaceuticalmechanismsmightbecloselyre

4、latedwiththeoverexpressionofNF kB，MCP 1inDMmodelgroupliver ， andinhibitingtheinflammatorypathogenesisinliver.【 Keywords 】 Insulinresistance;JieDuTongLuoTiaoGanSan;Nuclearfactor(NF) k B;Monocytechemoattractantpro tein(MCP) 1 胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的重要发病机制之一，但其具体的病理根底较为复杂， 国内已有中医药防治IR的临床及试验报道。前期工作说明1，解毒

5、通络调肝散能改善实验动物IR,为进一步探讨其改善IR的作用机制，本实验观察了解毒通络调肝散对实验性DM大鼠肝组织核因子 k B(NF k B、) 单核细胞趋化蛋白1(MCP 1)及 MCP 1mRNA 表达的影响，探讨肝组织 NF kB与MCP 1途径与T2DM、IR之间的关系。1 材料与方法1.1实验动物及分组清洁级8周龄雄性 Wistar大鼠60只(体重150170g)，购于吉林大学基础医学院，根底饲料(热量15J/g)由吉林大学实验动物中心提供，高脂饲料由吉林大学实验动物中心新鲜配制：根底饲料63%, 15%牛油，20%蔗糖，2%胆固醇，提供热量约20J/g，其中脂肪提供热量占总热量30

6、%。 60 只大鼠按体重随机分为正常对照组 8 只和 DM 模型组 52只。正常对照组给予根底饲料， 模型组给予高热量饲料。 4w 后，模型组腹腔注射 (ip)1.2%STZ 溶液 30mg/kg ，于注射 STZ1w 后测定糖耐量。按照国际通用大鼠 DM 诊断标准：血糖峰 值16.8mmol/L和120min血糖11.1mmol/L为DM，具备上述一条为糖耐量减低(IGT)2。取DM或IGT模型组动物为实验对象。将造模成功大鼠48只按血糖峰值分层，随机分为模型组(n=12)，中药组(n=12),二甲双胍组(n=12)，吡格列酮组(n=12)。3个治疗组分别每日定 时灌服解毒通络调肝散悬混液5

7、g kg-1 d-1、二甲双胍水溶液 0.5g kg-1 d-1、吡格列酮悬混液5mgkg-1d-1，动物自由进食饮水，正常对照组喂普通饲料，其他组喂高热量饲料。治疗周 期为8w。治疗结束时，纳入统计数据的动物数为：正常对照组8只，模型组8只，二甲双胍组 9只，吡格列酮组 10只，中药组 10只。1.2 药物及试剂解毒通络调肝散由长春中医药大学附属医院中医研究所提供;盐酸二甲双胍肠溶胶囊 (君力达 )：北京圣永制药;盐酸吡格列酮片 (瑞彤 )：江苏恒瑞医药股份有限公司。链脲佐菌素 (STZ：) 美国 Sigma 公司 ;末端全血葡萄糖测试条：北京怡成生物电子技术。胰岛素放免试剂盒购自北京东亚生

8、物技术。兔抗大鼠NF kB MCP 1多克隆抗体购自武汉博士德公司。1.3 检测指标及方法生化指标的检测血糖：怡成血糖仪检测；血清胰岛素：磁酶免分析仪1(美国Bio Rad)检测;胰岛素敏感指数(ISI): Ln(1/空腹血糖 空腹胰岛素)。SP法检测。一抗分别为1 : 100)；二抗均为山羊抗SP 试剂盒。严格按试剂肝组织 NF k Bp65 MCP 1 蛋白表达测定采用免疫组织化学 兔抗大鼠NF k Bp65工作浓度1 : 100), MCP 1多抗(工作浓度:兔IgG,生物素标记来自抗兔的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素 盒说明书进行。1.3.3 免疫组化染色半定量评分所有切片均由有经验的

9、病理科医师盲法阅片作出诊断,每张切片观察5个X 400视野。结果评定标准：着色程度：不着色者为0分，着色淡者为1分，中等着色为 2 分,着色深者为 3 分。着色细胞阳性范围：无着色 0 分,着色阳性细胞小于 1/3为1分，着色阳性细胞1/31/2为2分，着色阳性细胞大于 1/2为3分。将每张切片着 色程度与着色细胞阳性范围得分各自相加为其最后计分。肝组织MCP 1mRNA表达测定按Trizol试剂说明书。根据文献3合成MCP 1寡核 苷酸(PCR引物。MCP 1 引物序列：上游 5/ CACCTGCTGCTACTCATTCAC3T ;下游 5/GTTCTCTGTCATACTGGTCACTT3C

10、 。 GAPDH 引 物 序 列 ： 上 游 5 ACCACAGTCCATGCCATCAC7 ;下游 5/ TCCACCACCCTGTTGCTGTA/ 弓 I物由北京鼎国 生物技术开展公司合成。扩增条件为：94 C预变性 2min后进入如下循环：94 °C 45s,55C 45s, 72 C 45s,循环数为30个，最后于72 C延伸10min。扩增的MCP 1长度为 349bp, GAPDH长度为450bp。扩增产物用凝胶成像分析系统进行紫外光成像分析，以GAPDH密度作为参考定量标准，数值以两者之吸光度(Int)面积(Pix)比值表示，以对照组的比值作为标准 1.0,计算 MCP 1 基因相对表达量。1.4统计学处理数据以 x 土表示，采用SPSS13.0软件进行方差分析。2 结果2.1 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、 ISI 比拟大鼠饲养 4w 时,造模组大鼠平均空腹血糖显 著高于正常组(P0.01)，但未到达DM诊断标准。注射 STZ后大鼠空腹血糖、1及2h血糖水 平那么明显升高。12w末，治疗组大鼠血糖较模型组明显降低(P0.05, P0.01)，中药组与