测定细菌生长曲线

1、实验七 测定细菌生长曲线一、 实验目的1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时；2. 学习液体培育基的配制以及接种方法；3. 反复练习无菌操作技术；4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培育基上生长速度的不同；5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法二、 实验原理将肯定量的细菌接种在液体培育基内，在肯定条件下培育，可观察到细菌的生长繁殖有肯定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培育时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线（如图一）。 图一 微生物生长曲线示意图单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即调整期（延滞期）、对数期（生长旺盛期）、平衡期（稳定期）、死亡期（衰亡期）。

2、生长曲线可表示细菌从开头生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培育条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验接受比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培育时间作图，即可绘出该菌在肯定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培育液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。从生长曲线我们可

3、以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。其计算公式为： 式中t1和t2为所取对数期两点的时间；W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L）或OD。三、 实验仪器、材料和用具1. 实验材料:大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板；2. 培育基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培育基3. 实验仪器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培育箱, 摇床，722s分光光度计；4. 实验用具:无菌1000ul吸头80个;无菌5000ul吸头2个;比色皿9个+共用参比杯一个.四、 实验步骤1. 筹备菌种：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培育基中，37振荡培育18h，另外筹备单菌落平板各1块2. 分为

4、三个小组： 第（1）小组取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基, 37 200rpm取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 200rpm取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 200rpm第（2）小组 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培育基， 37 200rpm取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 110rpm取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培育基， 30 200rpm第（3）小组 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 37 200rpm取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 30 200rpm取1.0ml枯草杆菌接种到1

5、00ml培育基， 37 110rpm每培育一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次). 对比组测量起始pH,全部瓶子测量发酵9h结束测pH. 3. 测量：选用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开头培育前测定每组培育液的OD值作为起始点。开头培育后，每小时吸取测定一次OD值。 五、 实验结果及分析1. 实验数据：表一 三个小组时间-OD数据开头取样时间10:5512:0112:3913:1713:53结束取样时间9:5511:0112:0912:4713:2313:59发酵时间0122.533.5ODt大肠杆菌单菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.03637110rpm-

6、0.0100.0490.1640.2550.3120.32730200rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.3611.0mL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456枯草杆菌37200rpm0.0080.0230.0760.1320.1840.25430200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD=ODt-O

7、D0大肠杆菌单菌落0.0040.0200.0230.0230.0210.03237110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.3711.0mL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389枯草杆菌37200rpm0.0080.0150.0680.1240.1760.24630200rpm0.0130.0190.0390.0750.0780.1

8、1237110rpm0.0070.0100.0910.1230.2230.246开头取样时间14:2915:3516:4317:5018:5719:0720:12结束取样时间14:3515:4316:5017:5719:0920:0721:12发酵时间45678910ODt大肠杆菌单菌落0.0650.2670.3950.4540.45737110rpm0.3330.3400.3420.3600.36230200rpm0.4390.5660.5700.5880.5861.0mL0.4640.4460.4460.4580.4403.0mL0.4870.4700.4570.4830.4585.0mL

9、0.4690.4570.4640.4820.478枯草杆菌37200rpm0.3370.4280.5170.5900.6860.7110.71130200rpm0.1710.2610.3700.5400.6280.6060.65237110rpm0.2950.3020.3050.3050.3520.3520.378OD=ODt-OD0大肠杆菌单菌落0.0610.2630.3910.4500.45337110rpm0.3430.3500.3520.3700.37230200rpm0.4490.5760.5800.5980.5961.0mL0.4540.4360.4360.4480.4303.0m

10、L0.4480.4310.4180.4440.4195.0mL0.4020.3900.3970.4150.411枯草杆菌37200rpm0.3290.4200.5090.5820.6780.7030.70330200rpm0.1580.2480.3570.5270.6150.5930.63937110rpm0.2880.2950.2980.2980.3450.3450.3712. 作图、简要分析及代时计算：1） 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培育基， 37 200rpm图一 单菌落大肠杆菌生长曲线 这条曲线属于比较标准的“S”形曲线，很容易看出调整期和对数期，由于单菌落菌较少，而且从固体培

11、育基转移至液体培育基环境变化较大，所以消失了长达4小时的调整期，但可以看出，调整期之后这瓶菌都生长良好。计算代时：取培育4小时到5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.061 W2=0.263代时 2） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 110rpm 图二 大肠杆菌菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培育基，37 110rpm）接种后几乎没有调整期消失，大肠杆菌很快适应了新的环境并开头呈指数增长，估量是新的培育环境和原有环境较全都，而且在培育最初的时候溶氧和酸碱度都较为适宜，但是这瓶菌是稳定期OD最小的，估量是培育基最

12、初分装不均产生的。计算代时：取培育2小时到2.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=0.5h W1=0.174 W2=0.265代时 3） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，30 200rpm图三 大肠杆菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培育基，30 200rpm）可以看出温度对大肠杆菌适应环境产生了肯定的影响，使它在调整期滞留了较长的时间，且在对数期增长较慢，应该是酶活性对细胞复制的影响所致。计算代时：取培育2.5小时到3.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.168 W2=0.371代时

13、 4） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基, 37 200rpm图四 大肠杆菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培育基, 37 200rpm）这是大肠杆菌培育的最适调节，可以看出其生长良好，调整期较短，对数期较长。计算代时：取培育2小时到3小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.148 W2=0.362代时 5） 取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 200rpm 图五 大肠杆菌生长曲线（取3.0ml大肠杆菌接种到100ml培育基，37 200rpm）接种量的增加没有产生太大的影响，生长曲线没有太大变化。计算代时

14、：取培育2小时到2.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=0.5h W1=0.218 W2=0.334代时 6） 取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 200rpm图六 大肠杆菌生长曲线（取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培育基，37 200rpm）3小时消失了一次明显的波动，应该是测量过程中没有摇匀的结果，忽视它之后，这条生长曲线属于正常形态，比较前两天生长曲线，发现5mL得到的最大OD反而减小了，说明在肯定量的培育基下，初始接种量对最后结果影响不大。最大OD应该是受到了最初添加培育基的影响。计算代时：取培育1小时到2小时之间的数据（对数生

15、长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.067 W2=0.235代时 7） 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 37 200rpm图七 枯草杆菌生长曲线（取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 37 200rpm）枯草杆菌的生长曲线包含了调整期、对数期和很小一部分稳定期，虽然稳定期很短，但是已经可以看出停止生长的趋势，说明枯草杆菌的代时较长。计算代时：取培育3小时到4小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.176 W2=0.246代时 8） 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 30 200rpm图八 枯草杆

16、菌生长曲线（取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 30 200rpm）温度降低后，生长变得缓慢了，最后达到的最大OD也更小了，代时加长。计算代时：取培育4小时到5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.158 W2=0.248代时 9） 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 37 110rpm图九 枯草杆菌生长曲线（取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培育基， 37 110rpm）4小时时，似乎由对数期进入了稳定期，但是对比前两组数据，此时的OD值明显偏小，所以分析，可能此时突然有外因影响，使细胞进入了调整期，可以看到后来7、8小时左右

17、细菌又有增长趋势。计算代时：取培育2.5小时到3小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.123 W2=0.223代时 3. 发酵结束pH对比组pH=7.5实验结束后全部瓶pH均小于6.4pH全部降低，说明大肠杆菌和枯草杆菌发酵均产生了酸。4. 分析表二 不同环境和菌种生长比较培育菌接种量培育温度/ 摇床转速/rpm生长曲线状态代时/min调整期/h对数期/h稳定期OD(取8小时OD）大肠杆菌单菌落37200430.45328.5 1.0mL37110130.37249.4 1.0mL30200230.59652.5 1.0mL37200130.4304

18、6.5 3.0mL37200120.41948.7 5.0mL37200120.41133.1 枯草杆菌1.0mL37200260.67866.5 30200350.61592.2 37110130.34534.9 1） 接种量对微生物的影响：预期：接种量大，调整期缩短，对数期增长，稳定期OD增大，代时缩短。缘由：接种量大的细胞基数大，因而更快适应环境。实际：调整期影响不大，对数期稍有缩短，稳定期OD减小，代时规律不明显。分析：生长曲线受各种因素调节，这里实验结果不同于预期应该是受到培育基的限制，接种量大对氧气和原料需求更多，而且产生酸的速度也快，也许对后来的细胞生长造成了肯定的影响。2） 培

19、育温度对微生物的影响预期：最适温度下细胞生长应该最快，调整期最短，稳定期OD最大，代时最短缘由：温度影响细菌内酶活力和细胞膜的通透性，进而影响新陈代谢，从而影响细菌的生长繁殖。最适温度下，细菌酶活性最强，因而能最快适应环境，并取得生长增殖的最高效率。实际：大肠杆菌37稳定期OD最大，调整期更短，但代时更长。枯草杆菌37调整期更短，对数期更长，稳定期OD更大，代时更短。分析：大肠杆菌代时的问题应该来自实验误差，如取样未摇匀、计算时取点不够精确，或实验过程中某些操作导致生长和理论不全都。3） 摇床转速对微生物的影响预期：转速高，调整期短，对数期长，稳定期OD大，代时短缘由：转速影响溶氧，溶氧高，生

20、长情况应该越好实际：大肠杆菌与预期符合；枯草杆菌转速快的调整期长，代时长。分析：缘由可能有两点，一是枯草杆菌在溶氧高的环境下生长没有那么好，说明它是微好氧生物，但这与实际不符；二是其他条件限制，虽然说两个培育瓶进行对比要求其他条件全都，但是由于培育基安排及其其他各种缘由，其他条件可能并不全都而且还产生了比对比条件还要大的影响。4） 生长曲线分析两个菌的生长曲线都包括了调整期、对数期和稳定期，实验没有进行到衰亡期由于而没有观察到后来的OD值下降。5） 大肠杆菌和枯草杆菌比较大肠杆菌：代时要短一些，温度对代时的影响比溶氧对代时的影响要大，估量是由于溶液中细胞不多，所以溶氧的限制作用没有温度明显。枯

21、草杆菌：代时较长，溶氧比温度对代时的影响要大，但这也可能是实验操作中其他因素影响而得出的表观结果。六、 实验小结这是一个大组合作、小组分工的实验，每一组的结果都影响了整个大组队结果的分析，这就要求我们的合作。和暑期实验不同，这次实验在时间上缩短了，但是在内容上却增多了，由于有很多组的平行比较，所以得到的信息量也相应加大，这些信息中又包含了这种各样的误差，所以要求我们自己在处理别人的实验结果中也加入自己的分析。总的来说，这是个很有意思也很有意义的实验。七、 思考1. 计算出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培育基中对数生长期中的代时(min)（繁殖一代的时间），为什么比理论时间长好多？代

22、时见表二。经查资料得：大肠杆菌理论代时为37度时18分钟，而枯草杆菌一般是给30度下的理论代时为31分钟，实验测得代时长于理论值的缘由： 理论代时是在抱负的培育条件下测得，糖分、氧气等营养物质供应充足，细菌生长状况良好，之前的分裂次数较少。实际实验条件与理论值条件存在差距。如培育过程中不补料，营养物质有限。单纯的振荡不能保证体系中有足够的溶氧。对培育液的pH值，氧化还原电势也未加掌握，测量过程中温度不能保持稳定等等。2. 为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况？培育液的浑浊度与细菌的浓度与成正比，可以利用分光光度计测定细菌浊液的光密度来推知菌液的浓度。浊度的变化代表体系细菌数量的变化。其原理是：一个细胞悬浮液用肉眼观察是呈现混浊的，这是由于光线通过悬浮液是，细胞散射光线。存在的细胞数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。通过分光光度计可以检出没有被细胞散射的光线。对于大肠杆菌和枯草杆菌，从理论上OD值与细胞总量成正比。可以制备将细胞数目与浊度联系起来的标准曲线。3. 生长曲线中为什么会有稳定期和衰退期？当细胞的繁