全外显子测序指南

1、ACMG全外显子测序指南摘要：美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）以前为序列突变的解释提供了指导.1在过去十年中，随着高通量测序的出现，测序技术迅速发展。通过采用和利用下一代测序，临床实验室正在进行基因分型，单基因，基因组，外显子，基因组，转录组和遗传疾病表观遗传学检测的不断增加的遗传检测目录。由于复杂性增加，基因检测的这种转变伴随着序列解释的新挑战。在这方面，ACMG于2013年召集了一个由ACMG，分子病理学协会（AMP）和美国病理学家学会的代表组成的工作组，重新审视和修订了序列突变解释的标准和准则。该组由临床实验室主任和临床医生组成。本报告代表ACMG，AMP和美国病理学家利益相关者

2、联盟组成的工作组的专家意见。这些建议主要适用于临床实验室使用的遗传检测的范围，包括基因分型，单基因，panel，外显子和基因组。本报告建议使用具体的标准术语 - “致病性”，“可能致病性”，“不确定性意义”，“可能良性”和“良性”来描述在导致孟德尔病症的基因中鉴定的突变。此外，该建议描述了基于使用典型类型的突变证据（例如，群体数据，计算数据，功能数据，分离数据）的标准将突变分类为这五个类别的过程。由于本报告中描述的临床基因检测的分析和解释的复杂性增加，ACMG强烈建议临床分子遗传学检测应在经过临床实验室改进修订批准的实验室进行，结果由相关职业认证的临床分子遗传学家或分子遗传病理学家或同等学科专

3、家进行解释。关键词：ACMG实验室指导; 临床遗传检测; 解释；报告; 序列变异术语；突变报告前言临床分子实验室正在不断增加检测的新的序列突变，因为在检测患者标本时不断发现大量与基因疾病相关的基因。 虽然一些表型与单个基因相关，但许多与多个基因相关。 我们对任何给定序列突变的临床意义的理解是循序渐进的，其范围从那些几乎肯定是疾病致病性突变到几乎肯定是良性的突变。 虽然以前的美国医学遗传学和基因组学会（ACMG）的建议提供了序列突变的解释类别和解释算法，但是这些建议没有提供定义的术语或详细的突变分类指南.1。本报告描述了关于序列变异分类的更新的标准和指南，由专家意见和经验数据确定的标准。方法在2

4、013年，由ACMG，分子病理学协会（AMP）和美国病理学家学会成员组成的工作组成立，代表临床实验室主任和临床医生，目的是制定使用标准术语的建议，以使用根据通过专家意见，工作组共识和社会投入制定的制度对现有证据加权。为了评估临床实验室的意见，调查发送到GeneT中列出的美国和加拿大的100多个测序实验室，要求输入术语偏好和评估变异分类的证据。实验室检测经验包括罕见疾病以及药物基因组学和体细胞癌检测。旨在评估术语偏好的第一项调查于2013年2月发布，结果在2013年ACMG年度会议的公开论坛上发布，其中包括75位与会者。调查对象在北美代表了超过45个实验室。 调查结果和公开论坛表

5、明，（i）使用“致病性”，“可能致病性”，“不确定性意义”，“可能良性”和“良性”这五个术语系统是首选的，已经在大多数实验室使用，以及（ii）工作组的首次努力应着重于孟德尔病和线粒体突变。在第一次调查中，实验室也被要求提供突变评估方案，11个人分享了他们的方法。通过分析所有提交的协议，工作组制定了一套标准来加权突变证据和一套组合标准以达到五个分类层之一的规则。工作组成员使用已知类别的突变在其实验室和/或更广泛的范围检测了该方案数周。此外，对具有最常见类型证据的突变的典型示例进行了分类分配，以确保系统根据工作组成员当前应用的方法对这些突变进行分类。第二次调查于2013年8月发送给那些相同的通过G

6、eneTests确认的实验室，以及通过AMP的约2,000个成员，以及提出的分类方案和详细的补充描述如何使用每个标准的实验室。实验室被要求使用该方案，并就每个标准的适用性和相对权重，分类系统的易用性以及是否在本国实验室采用这种系统提供反馈。超过33个实验室的回应表明多数支持拟议的方法，反馈意见进一步指导了拟议标准和准则的制定。2013年11月，工作组在AMP会议上与50多名与会者举行了研讨会，介绍了修订的分类标准和两个潜在的评分系统。一个系统与这里提出的方法一致，另一个系统是一个点系统，其中每个标准给出了一些点，为病原标准指定积极点和良性标准的负点，从而对所以突变的分类进行了定义。通过观众回应

7、系统，参与者被问及如何在评估突变证据时对每个标准（强，中等或支持或不使用）进行加权。同样，这些答复也纳入了这里介绍的分类系统。应该指出的是，虽然大多数答复者都赞成一个积分制，但工作组认为，为每个标准指定具体要点意味着对目前不支持科学评估的每个标准的定量水平的理解，并没有考虑到解释遗传证据的复杂性。工作组还对来自其他专业社会和工作组的建议进行了评估，其中已经制定了乳腺癌，结肠癌和囊性纤维化中良好基因的变异分类指南，以及用于定量评估选择性疾病变异的统计分析程序.2-5。虽然这些突变分析指南在特定环境中是有用的，但是很难将其提出的标准应用于所有基因和不同的实验室设置。本文中描述的突变分类方法适用于所

8、有孟德尔基因的突变，无论是通过单基因检测，多基因定位，外显子测序还是基因组测序鉴定。我们期望随着技术和知识的改进，这种突变分类方法将会发展。我们还应该注意，在特定疾病组中工作的那些人应该继续制定关于特定基因中突变分类的更集中的指导，因为赋予某些标准的适用性和重量可能因基因和疾病而异。一般考虑术语突变被定义为核苷酸序列的永久变化，而多态性定义为频率高于1的突变。 然而，广泛使用的术语“突变”和“多态性”通常分别导致由于不良假定的致病性和良性效应而引起的混淆。 因此，建议将两个术语用术语“突变”替换为以下修饰物：（i）致病性，（ii）可能的致病性，（iii）不确定的意义，（iv）可能良性或（v）良

9、性。 虽然这些修饰剂可能不涉及所有人类表型，但是它们包括与本指南中所述的与孟德尔病有关的突变的五级分类系统。 建议所有的致病的诊断（包括“可能致病”的报道）是相对于条件和遗传模式（例如，c.1521_1523delctt（p.phe508del），致病性，囊性纤维化，常染色体隐性遗传）。应该指出的是，一些实验室可能会选择拥有额外的分类层级（例如，对具有不确定意义的突变进行分类，特别是内部使用），这种做法不被认为与这些建议不一致。还应该指出，这里推荐的术语与目前用于分类细胞遗传学微阵列检测的拷贝数变异的建议有所不同.6。推荐用于拷贝数突变的模式，同时包括五个层次，使用“不确定的临床意义 - 可能

10、致病性“和”不确定的临床意义 - 可能良性“。大多数工作组不支持使用“不确定的意义 “术语修改为”可能致病”或“可能是良性”，因为认为这里提出的标准将突变分类为“可能”类别包括比拷贝数突变指南中概述的更强的证据，并且组合这两个类别将为接受临床报告的卫生保健提供者和个体造成混乱。然而，有人认为，使用术语“可能”应该限于数据支持很可能是致病性或很有可能是良性的突变。虽然术语“可能”没有定量定义，但在某些突变分类设置中已经提出了指导。然而，在ACMG公开论坛期间对协会的调查显示，“可能”一词的用途范围更广泛。认认识到这一点，我们建议将“可能致病性”和“可能良性”这一术语用于表示大于一个突变的90的确

11、定性是致病的或良性的，为实验室提供一个具有共同的，虽然是规定的定义，是疾病或良性的。同样，国际癌症研究机构准则2支持95的致病性确定性，但工作组（通过ACMG公开论坛的反馈确认）认为，临床医生和患者愿意容忍稍高一些的错误机率到90的决定。还应该指出，目前，大多数疾病具有异质性，大多数突变没有数据来支持对五个类别中的任何一个的突变确定性的定量分配。 希望随着时间的推移，将会开发客观地将变异的致病性信心的实验和统计学方法开发出来，并且采用更加严格的方法来定义临床协会在信心方面的期望，将更充分地说明术语和可能性。使用新术语可能需要协会的教育。鼓励专业协会对所有实验室和保健提供者进行教育，使用这些术语

12、，并鼓励实验室直接教育其对应医师。命名方法推荐通过一组标准化标准通知的统一命名法，以确保明确指定突变，并能够有效共享和下游使用基因组信息。 标准基因变异命名法（）由人类基因组变异学会（HGVS）7维护和版本化，其使用被推荐作为确定变异命名法的主要准则，除非另有说明。6 实验室应注意检测中使用的版本。 工具软件可用于提供正确的HGVS术语，用于描述突变（）.8。临床报告应包括序列参考，以确保在DNA水平上对突变进行明确的命名，以及提供编码蛋白质命名法以协助功能性解释（例如，“g.”，用于基因组序列，“c.”，用于编码DNA序列，“p.”用于蛋白质，“m.”用于线粒体）。应使用ATG翻译起始密码子

13、的“A”作为位置号1来描述编码术语。如果使用历史替代命名法，则应使用当前命名法以及历史命名的附加符号。 参考序列应该是完整的，并且来自国家生物技术信息中心RefSeq数据库（/RefSeq/)9，其版本号或Locus参考基因组数据库（http： / ）.10。基因组坐标或一个涵盖整个基因的基因组参考序列(包括5'和3'未翻译的区域和启动子)应该根据标准的基因组构建来使用和定义(例如:hg19) 。在描述编码突变时，应在报告中使用并提供每个基因的参考文献。转录应代表最长的已知记录和/或最临床相关的记录。学会支持的参考文献通常可以

14、通过Locus Reference Genomic10， Consensus CDS数据库，11人基因突变数据库（http：/www.hgmd。），ClinVar（http：/www.ncbi。）或轨迹特异性数据库查询。 然而，实验室应该评估突变对所有临床相关转录物的影响，包括在这些区域中已知的突变在临床上可解释时含有额外的外显子或扩展的非翻译区的替代转录物。并非所有类型的突变（例如，复杂突变）都被HGVS建议所涵盖，但可能可以被已经报告了复杂突变所描述.7,12。此外，该ACMG建议支持HGVS命名规则的三个具体例外：（i） 除了目前的HGVS“*”和“Ter”建议之外，“X”仍然被认为可以

15、用于报告无义突变。 （ii）建议根据用于指定突变的选定参考文献编号外显子; 和（iii）推荐使用术语“致病性”而不是“影响功能”，因为临床解释通常直接评估致病性。文献资料库的使用大量数据库包含在人类基因组中不断发现的越来越多的突变。 在分类和报告突变时，临床实验室可能会在数据库以及已发表的文献中找到有价值的信息。 如上所述，序列数据库也可用于鉴定适当的参考序列。 数据库可用于收集信息，但应谨慎使用。人类数据库（表1）可用于获取大群体变异频率。 人类数据库不能被认为仅包括健康个体和已知含有致病性突变。 这些数据库不包含关于这些突变的功能效应拓展性信息或任何可能的相关表型。 当使用人类数据库时，必

16、须确定是使用健康队列还是疾病队列，如果可能，还应确定最好包括家庭中的一个以上个体以及符合受试者的年龄范围。疾病数据库（表1）主要包含在患有疾病的患者中发现的突变并评估突变的致病性。 疾病和基因特异性数据库通常包含错误分类的突变，包括在同行评议的文献中发布的不正确的索赔，因为许多数据库不执行证据的初步审查。 当使用疾病数据库时，重要的是考虑如何确定患者，如下所述。当使用数据库时，临床实验室应该（i）确定数据库更新的频率，数据策划是否得到支持，以及使用什么方法进行策划; （ii）确认使用HGVS命名并确定用于命名突变的基因组构建和转录物参考; （iii）确定数据的分析准确度（例如，低通次下一代测序

17、与Sanger验证的突变）的程度，并评估提供用于评估数据准确度的任何质量度量，这可能需要阅读相关出版物; 和（iv）确定所列观察的来源和独立性。变异评估还包括搜索科学文献和医学文献。 使用较旧的术语和分类或基于单次观察的文献应谨慎使用。 当识别具有突变的个体和家庭以及相关表型时，重要的是考虑如何确定患者。 评估发表的数据时，这一点很重要，因为受影响的个人和相关个人经常被报告多次，这取决于研究的背景和大小。 这可能是由于作者重叠，实验室间合作，或者是不同临床系统之间的先证者和家庭成员。 这可能会错误地导致受影响患者的重复计数和变异频率的虚假增加。重叠的作者或机构是重叠数据集的潜力的第一线索。临床

18、实验室应实施内部系统，以跟踪每个基因中鉴定的所有序列变异和报告时的临床诊断。 这对于跟踪基因型 - 表型相关性和受影响和正常人群中变异体的频率非常重要。 鼓励临床实验室对诸如ClinVar等突变数据库做出贡献，包括用于变异分类的临床断言和证据，以帮助持续了解人类变异的影响。 只要有可能，应根据“健康保险可移植性和责任法案”隐私规定提供临床信息。鼓励临床实验室与临床医生形成合作，提供临床信息，以更好地了解基因型如何影响临床表型，并解决实验室之间变异解释的差异。 由于辅助临床实验室实践的巨大潜力，正在努力扩大和标准化临床突变数据库。 标准化将更容易获得更新的信息，并便于临床实验室提交。 例如，Cl

19、inVar数据库允许通过临床观察和诊断来确定突变位点，并且跟踪检查状态，以使对策略质量水平的透明度更高。计算（计算机）预测程序公开和商业上可用的各种计算机工具可以帮助解释序列突变。 每个工具使用的算法可能不同，但可以包括确定序列突变在核苷酸和氨基酸水平的影响，包括检测突变对初级和替代基因转录物，其他基因组元件的影响，以及 、该突变对蛋白质的潜在影响。 这些工具主要的两个类别包括那些预测错误变化是否损害所得蛋白质功能或结构的工具，以及预测是否对剪接有影响的工具（表2）。 更新的工具开始解决额外的非编码序列。13错误变化的影响取决于诸如氨基酸或核苷酸进化的保守性，蛋白质序列内的位置和上下游以及氨基

20、酸取代的生物化学结果等标准。这些标准中的一个或组合的测量用于评估错误改变的预测影响的各种计算机算法。有几项努力评估了可用的预测软件的性能，以便将它们相互比较，并评估其预测“已知”致病突变的能力.14-17。一般来说，大多数误差变异预测算法的准确度为65-80检查已知的疾病突变。16大多数工具往往具有较低的特异性，导致错误更改过早预测有害，并且在预测具有较高效果的错误突变方面不可靠.18临床实验室中更常用于错误突变解释的计算机工具包括PolyPhen2，19 SIFT，20和MutationTaster.21表2中可以找到用于预测错误突变的计算机工具列表。已经开发了多个软件程序来预测剪接，因为它

21、与在外显子或内含子水平上的剪接位点的产生或丧失有关.22一般来说，剪接位点预测工具相对于特异性（90-100）具有更高的灵敏度 60-80）预测剪接位点异常.23,24通常用于剪接位点突变解释的一些计算机工具列在表2中。虽然许多不同的软件程序使用不同的算法进行预测，但它们的基础有相似之处; 因此，从不同的计算机工具组合的预测被认为是序列解释中的单一证据，而不是独立的证据。 还推荐使用多个软件程序进行序列突变解释，因为不同的程序每个都有自己的优点和缺点，这取决于算法; 在许多情况下，性能可以由基因和蛋白质序列变化决定。 然而，这些只是预测，并且应该仔细地实施它们在序列突变解释中的使用。 不建议将

22、这些预测用作作为临床断言的唯一证据来源。对序列变异的解释标准用于评估突变证据的方法旨在解释在临床诊断实验室环境中疑似遗传（主要是孟德尔）病症的患者中观察到的突变。 它不是用于解释体细胞变异，药物基因组（PGx）突变或与多基因非孟德尔复合障碍相关基因的突变。 在外来组织或基因组研究的背景下，将这些规则应用于候选基因（“不确定的基因”（GUS）时，必须注意，因为本指南并不旨在满足研究界在确定疾病中的新基因的需要。虽然这些方法可用于评估健康个体中发现的突变或继发性检测指征，但如指南中的几个部分所述，必须进一步注意，因为与指示无关的大多数突变是致病性的。虽然我们期望，一般来说，这些指南将适用于突变分类

23、，无论通过单个基因，基因组，外显子，基因组或转录组的分析来确定突变，重要的是考虑牵连变异体之间的差异作为可能被预测为其编码但不一定涉及疾病的蛋白质具有破坏性/破坏性的疾病和突变的致病性（即致病性）。这些规则旨在确定在孟德尔病症中具有确定作用的基因中的突变是否可能是该病症的致病性。致病性检测应独立于在给定患者中解释疾病的原因。例如，一个突变不应该在一种情况下报告为致病性，而不是在另一种情况下报告为致病性，仅因为该突变在某种情况下不被认为解释疾病。致病性应由整个证据的整体确定，包括所有研究的病例，得出一个结论。这种分类方法可能比实验室迄今应用的要严格得多。 它们可能导致较大比例的突变被归类为不确定

24、的意义。 希望这种方法将减少大量的变异报告为疾病的“病因”，因为没有足够的支持证据证明该分类。 重要的是要记住，当临床实验室将突变报告为致病性时，医生很可能将其视为“可行动的”，并改变对患者的治疗或监视25或者去除对该基因阴性的家庭成员的管理，基于这一决定（见下面的卫生保健提供者如何使用这些指南和建议）。我们提供了两套标准：一种用于分类致病性或可能的致病性突变（表3），一种用于良性或可能良性突变的分类（表4）。每个致病标准被称为非常强（PVS1），强（PS1-4）;中度（PM1-6）或支持（PP1-5），并且每个良性标准被加权为独立（BA1），强（BS1-4）或支持（BP1-6）。每个类别中的

25、编号不表示任何重量差异，只是标记为帮助参考不同的标准。对于给定的突变，用户根据对突变观察到的证据来选择标准。然后根据表5中的评分规则组合标准，从五层系统中选择分类。这些规则适用于所有可用的突变数据，无论是从当前被调查案件收集，还是从以前公布的数据中获悉。还可以通过公共资源（例如，ClinVar或基因座特定数据库）和实验室自己的数据库获得未发布的病例数据。为了提供突变分类的标准的灵活性，根据所收集的证据，可以使用专业判断将一种重量的标准移动到另一种重量。例如，如果一个反式突变（在反式染色体上）的检测值是在其他致病性突变检测突变的数倍（参见PM3 BP2顺式/反式检验进一步指导），则PM3可以升级

26、为强。相比之下，在数据不如所述的那么强的情况下，可以使用判断来将证据视为履行较低级别（例如参见PS4，表3中的注2）。如果一个突变不符合使用这些组（致病性或良性）的标准，或者良性和致病性的证据是相互冲突的，那么突变默认为不确定的意义。按类型和实力组织的标准如图1所示。请注意，在评估全部证据以解释突变证据强度的差异时，必须采用专家判断。提供以下内容以更彻底地解释突变分类标准中注明的某些概念（表3和4），并提供其使用中的示例和/或注意事项或陷阱。本节应与表3和表4相一致。PVS1无义突变通常可以假设某些类型的突变（例如，废话，移位，正常的±1或2个剪接位点，起始密码子，单个外显子或多重缺

27、失突变）通过缺少转录而导致完全不存在基因产物来破坏基因功能或无义介导的衰变导致转录物的改变。 但是，通过考虑以下原则，将这些突变分类为致病性时，请谨慎行事：（i） 当将这些突变分类为致病性时，必须确保无效突变是已知的致病性机制，与确定的疾病遗传模式一致。 例如，存在仅杂合错义突变导致疾病的基因，而无义突变在杂合状态中是良性的（例如，许多增生性心肌病基因）。 仅基于该证据，MYH7基因中的新型杂合无义突变将不被认为是主要肥厚性心肌病的致病性，而CFTR基因中的新型杂合无义突变可能被认为是隐性致病突变。（ii） 患者具有与中祖辈相一致的疾病（例如，未受影响显性遗传病的父母）。 然而，由于种系嵌合，

28、有可能影响其他兄弟姐妹。（iii） 患者的表型与合理的特异性匹配基因的疾病关联。 例如，对于具有独特面部特征，多毛症和上肢缺陷（即Cornelia de Lange综合征）的NIPBL基因中具有隔代遗传的患者，这一观点是强的，而在具有非特异性特征如发育迟缓的儿童中通过外显子测序发现的突变，隔代遗传则较弱。 PS3 BS3功能研究功能研究可以成为支持致病性的有力工具; 然而，并非所有功能研究都可以有效预测基因或蛋白质功能的影响。 例如，某些酶检测提供了确定的方法来评估错义突变对代谢途径（例如-半乳糖苷酶功能）中酶功能的影响。 另一方面，一些功能测定可能不太一致地预测突变对蛋白质功能的影响。 为了

29、评估功能测定的有效性，人们必须考虑功能测定反映生物环境的程度。 例如，从患者或动物模型的活检组织直接测定酶功能提供比在体外表达蛋白质更强的证据。同样地，如果测定反映了蛋白质的完整生物学功能（例如，酶的底物分解）与仅具有一个功能组分（例如具有附加结合特性的蛋白质的三磷酸腺苷水解）相比，证据力度更强。评估测定的分析性能和考虑样品完整性的验证，重现性和稳健性数据可能受到采集方法和时间以及储存和运输的影响，是重要的考虑因素。在临床实验室改进修订实验室开发的测试或市售试剂盒中的测定中，这些因素得到缓解。评估突变在信使RNA水平的影响的测定在评估突变在剪接点和编码序列和非翻译区以及更深的内含子区域（例如，

30、信使RNA稳定性，加工或翻译）中的影响时可以是高度信息的）。技术方法包括RNA和/或互补DNA衍生物的直接分析和体外小基因剪接测定。PS4 PM2 BA1 BS1 BS2突变频率和使用控制人群评估对照或一般群体中突变的频率对于评估其潜在的致病性是有用的。 这可以通过搜索公开的人口数据库（例如，1000个基因组计划，国家心脏，肺和血液研究所外显子测序项目外显子突变服务器，外显子聚合联盟;表1），以及使用经常在文献中出现的竞争匹配的对照数据。外显子测序项目数据库对白种人和非裔美国人群有用，并具有覆盖数据以确定突变是否不存在。 尽管1000种基因组计划数据不能用于评估突变的缺失，但是它具有不同种族群

31、体的更广泛的代表性。 外显子聚集联盟最近发布了来自不同人群的60000个外显子等位基因频率数据，包括大约三分之二的外显子测序项目数据。一般而言，控制群体的等位基因频率大于疾病预期（表6），被认为是对罕见孟德尔病症（BS1）的良性解释的强大支持，或者如果超过5，则被认为是立场独立支持（BA1）。此外，如果正在研究的疾病在早期完全渗透，并且在隐性（纯合），显性（杂合）或X连锁（半合子）病症的良好记录的健康成年个体中观察到突变，则被认为是良性解释的有力证据（BS2）。如果该突变不存在，则应确认数据库中的读取深度足以在突变站点进行准确的调用。如果一个突变不存在（或低于预期的载体频率，如果是隐性的）大的

32、普通人群或对照队列（> 1,000个人），并且群体与携带识别的突变的患者进行种族匹配，则可以考虑该观察一个适度的致病性证据（PM2）。然而，许多良性突变是“私人的”（个人或家庭独有的），因此不符合种族匹配的人群不被认为是足够的，甚至是致病性的强有力证据。当群体表型良好，频率差异较大，孟德尔病发病早期发病时，使用人口数据进行病例对照比较是非常有用的。 转诊到临床实验室进行测试的患者很可能包括被 “排除”为该疾病的个体，因此他们可能是不符合表型的病例。 当使用普通人群作为对照组时，患有亚临床疾病的个体总是存在的。 然而，在这两种情况下，病例对照比较在检测差异方面的功能不足; 因此，如上所述，

33、仍然可以假设显示出统计学上显着的差异来为致病性提供支持性证据。 相比之下，缺乏统计学差异，尤其是极度稀有的变异和较少的渗透性表型，应该谨慎解释。优势比（OR）或相对风险是基因型（即突变存在于基因组中）和表型（即受疾病/结果影响）之间关联的量度，可用于孟德尔疾病或复合物表征。在本指南中，我们只讨论其在孟德尔病中的用途。虽然相对风险与OR不同，但相对风险渐渐地接近OR的小概率。 OR为1.0意味着该突变不影响患有疾病的可能性，值高于1.0表示变异与疾病风险之间存在关联，而低于1.0的值意味着突变与疾病风险一般来说，具有适度孟德尔效应大小的突变将具有3或更大的OR，而高度渗透突变将具有非常高的OR；

34、例如，与E3 / E3纯合子相比，APOE E4 / E4纯合子的OR为13（https：/ / home / education-outreach / past-summer-interns / 2012- summer-interns / erika- kollitz.aspx.VOSi3C7G_vY）。然而，OR的置信区间（CI）与关联本身的度量一样重要。 如果CI包括1.0（例如，OR = 2.5，），则关联的断言几乎没有信心。在上述APOE示例中，CI为10-16。 互联网上提供非常简单的OR计算器（例如和 PM1突变热点和/或关键与完善的功能域已知某些蛋白质

35、结构域对于蛋白质功能是至关重要的，并且迄今为止鉴定的这些结构域中的所有错义突变已被证明是致病性的。 这些领域也一定缺乏良性变异。 此外，报道了在不太好表征的基因区域中的突变热点，在该区域中一个或几个附近残留物中的致病突变可以更大的频率观察到。 而这可以被认为是致病性的中度证据。PM3 BP2顺/反试验检测亲本样品以确定突变是否发生在顺式（基因的相同拷贝）或反式（基因的不同拷贝）中）对于评估致病性是重要的。 例如，当在隐性病症的基因中鉴定了两种杂合突变时，如果已知一种突变是致病性的，则确定另一种突变是反式的，可以被认为是后一种突变（PM3）的致病性的适度证据。 此外，如果该反式变异体其他致病性变

36、异有多个观察结果，则此证据可以升级至强。 然而，如果突变在普通人群中存在，则需要统计学方法来控制随机共生。 相比之下，找到顺式的第二个突变将支持尽管不是确定性的证据是良性作用（BP2）。 在隐性基因中鉴定有不确定致病性的两种杂合变异的情况下，突变的顺式与反式性质的确定不一定提供关于任一突变的致病性的附加信息。 然而，如果突变以顺式发现，则基因的两个等位基因都受到影响的可能性降低。  在显性疾病的背景下，反式突变被检测为致病性突变可以被认为是支持良性影响的证据（BP2），或者在某些发达的疾病模型中，甚至可以被认为是独立的证据，如已经被验证可用于评估CFTR突变3。由于框内缺失/插入和停

37、止损失导致PM4 BP3蛋白长度变化通过将终止密码子改变为氨基酸密码子（例如止血药物突变），一个或多个氨基酸的缺失或插入以及蛋白质的延伸更可能与单独的错误改变相比破坏蛋白质功能， 蛋白质长度变化的结果。 因此，框内缺失/插入和停止损失被认为是致病性的适度证据。 删除，插入或延伸越大，缺失区域中氨基酸越保守，支持致病性的证据就越大。 相比之下，在重复区域或进化中不够保守的区域的小框内缺失/插入不太可能是致病的。PM5在同一个位置新发的错义突变发生在与另一致病性错义变化相同位置（例如，Trp38Ser和Trp38Leu）的新型错义氨基酸变化被认为是适度的证据，但不能被认为是致病性的。 如果与确定的

38、致病性错义突变相比，新颖的变化更保守，这是特别真实的。 此外，不同的氨基酸变化可导致不同的表型。 例如，FGFR3基因的Lys650残基的不同取代与广泛的临床表型相关：p.Lys650Gln或p.Lys650Asn引起轻度软骨发育不全; p.Lys650Met导致发育迟缓和黑棘皮病严重软骨发育不全; 异位发育不良2型，致死性骨骼发育异常，来自p.Lys650Glu。PP1 BS4分离分析在家族中使用突变分离时，必须注意其作为致病性的证据。事实上，家族中具有表型的特定突变的分离是证实基因座与病症的连锁，而不是突变本身的致病性的证据。已经公布的一种统计学方法29,30，其中指出，鉴定的突变可能与该

39、家族中真实致病突变的连锁不平衡。统计学建模考虑到与年龄有关的外显率和感染率，采用先进的方法也将计算机预测与已知致病性变异共同出现为单一的定量测定的致病性.31。远亲很重要，应该被考虑在内，因为它们的比核心家族中的成员发生疾病和突变的可能性小。全基因测序（包括整个内含子和5'和3'非翻译区）可能提供更多的证据表明另一个突变不涉及或鉴定可能导致其他突变。除非仔细评估遗传基因座，否则有可能将非致病性突变分类为致病性。 当靶基因中的特定变异与多种受影响的家族成员和来自不同种族背景的多个家族中的表型或疾病分离时，连锁不平衡和确定偏倚不太可能混淆致病性的证据。 在这种情况下，这个标准可以视

40、为适度或强有力的证据，这取决于隔离的程度，而不是支持证据。另一方面，缺乏具有表型的突变的分离提供了强烈的抗致病性的证据。 需要仔细的临床评估来排除所报告的未受影响个体的轻度症状，以及可能的遗传因素（由于非致病性或不同遗传原因引起的疾病的受影响个体）。 此外，需要确定生物家庭关系，以排除收养，非亲子，精子和卵子捐赠以及其他非生物关系。 还必须考虑减少和年龄依赖性外显率，以确保无症状的家族成员真正不受影响。在临床实验室设置中，分离的统计学评估可能是困难的。 如果有适当的家庭，鼓励临床实验室与统计学或群体遗传学专家合作，以确保适当的建模，并避免该突变与疾病的相关性的不正确结论。PP2 BP1变异谱许

41、多基因具有明确的病原性和良性变异谱。 对于其中错义变异是疾病常见病因的基因，并且基因的非常少的良性变异，新的错义突变可以被认为是支持致病性的证据（PP2）。 相比之下，对于截短突变是唯一已知的变异致病机制，错义突变可以被认为是支持良性影响的证据（BP1）。 例如，ASPM中的截短突变是该基因中的致病突变的主要类型，其引起常染色体隐性原发性小头症，并且该基因具有高的错义多态性变异率。 因此，ASPM中的错误突变可以被认为具有这种支持性证据的一个良性影响。PP3 BP4计算（硅片）数据没有高估计算的证据是重要的，特别是考虑到不同的算法可能依赖于相同（或类似的）数据来支持预测，并且大多数算法还没有被

42、证实是针对已经确定的致病突变。 此外，算法可以对不同的基因具有非常不同的预测能力。 如果测试中的所有计算机程序符合预测，那么这个证据可以算作支持。 然而，如果在电脑预测中不通过，则不应将此证据用于分类突变。 这种突变导致氨基酸变化存在于多个非人类哺乳动物物种中的保守的区域，表明氨基酸变化不会损害功能，可以被认为是良性解释的强有力证据。 然而，如果该基因最近在人体中发生突变（例如涉及免疫功能的基因），则必须谨慎地评估对非保守区域有良好的影响的假设。PP4使用表型来支持突变的声明、一般来说，患者具有与基因的已知临床特征谱相匹配的表型的事实不被认为是致病性的证据，因为几乎所有接受疾病靶向测试的患者都

43、具有所述的表型。 然而，如果满足以下标准，患者的表型可以被认为是支持证据：（i）临床检测的敏感性高，大多数患者在该基因中检测出致病性突变阳性; （ii）患者具有明确的综合征，与其他临床表现几乎没有重叠（例如，Gorlin综合征，包括基底细胞癌，掌跖凹陷，牙源性角化囊肿）; （iii）基因不受实质性良性变异的影响，可以通过大量普通人群进行确定（例如，Exome测序项目）。 和（iv）家族史与疾病遗传模式一致。PP5 BP6信誉来源越来越多的例子来自信誉良好的来源（例如，在疾病领域具有长期专业知识的临床实验室）的致病性分类已经在数据库中共享，但没有提供形成分类基础的证据，可能不容易获得。 在这种情

44、况下，如果最近提交的分类可以用作单一证据。 然而，鼓励实验室分享分类基础，并与提交者沟通，以使基础证据得到评估和建立。 如果证据可用，则不应使用该标准; 相反与证据相关的标准则可以使用。BP5位置改变的观察当在具有明确的候选遗传病因的情况下观察到突变时，通常认为这是支持将该突变分类为良性的证据。 但是，也有例外。 个体可以是隐性疾病的不相关致病突变的载体; 因此，与隐性病症的基因相比，这种证据对于显性疾病的基因中可能的良性变异分类的支持更强。 此外，存在多种突变可导致更严重疾病的疾病。 例如，两种突变，一种致病和一种新型，在患有显性疾病严重表现的患者中被鉴定出来。而他父母中也与一人有轻度疾病。

45、 在这种情况下，必须考虑新型突变也可能是致病性并有助于先证者疾病严重程度增加的可能性。 在这种临床情况下，观察作为第二突变的新突变将不支持新型突变的良性分类（尽管它也不被认为是支持病原性分类而没有进一步证据）。 最后，存在已知发生多基因遗传的某些疾病，例如Bardet-Beidel综合征，在这种情况下，第二个基因座中的另外的变异体也可能是致病性的，但应谨慎地报告。BP7同义突变越来越多的认识到，剪接缺陷超过剪接共有序列的破坏，可能是致病性的重要机制，特别是对功能丧失是疾病的常见机制的基因。因此，假设同义核苷酸变化将不起作用，应该谨慎。然而，如果核苷酸位置在进化过程中不保守，并且剪接评估算法既不

46、预测对剪接共有序列的影响也不预测新的替代剪接共有序列的产生，则拼接影响不太可能。因此，如果支持计算证据（BP4），则可以将新颖的同义突变分类为可能是良性的。然而，如果计算证据表明对剪接有可能的影响，或引起怀疑的影响（例如，该突变与隐性疾病的基因中的已知致病变异体发生反应），则该突变应被分类为不确定的意义直到功能评估可以提供更明确的影响评估或提供其他证据来排除致病作用。报告的突变序列撰写简明扼要但内容丰富的临床报告可能是一个挑战，因为内容的复杂性从单基因报告突变到多基因组到外显子和基因组。已经制定了几个指导性文件，用于报告，包括ACMG下一代测序指导的临床实验室标准的完整样本报告.32-35。临

47、床报告是实验室检测的最终产品，经常被纳入患者的电子健康记录。因此，有效的报告简洁易懂。报告应用清晰的语言编写，避免使用医学遗传术语或定义这些术语。该报告应包含测试执行的所有基本要素，包括结构化结果，解释，参考，方法和适当的免责声明。报告的这些基本要素也被临床实验室改进修订法规和美国病理学家学院下一代测序临床试验的实验室标准强调。36结果结果部分应列出使用HGVS命名的突变（参见命名法）。鉴于在基因检测中发现的突变数量不断增加，以表格形式呈现基本组分的突变可以最好地传达信息。这些组分包括核苷酸（基因组和互补DNA）和蛋白质水平，基因名称，疾病，遗传，外显子，接合度和突变分类两者的命名。补充附录S

48、1在线提供了报告突变结构要素的表格示例。如果已知母亲来源也可能包括在内。此外，如果在基因分型测试中分析了特异性突变，实验室应特别注意询问的突变，如果存在，它们具有完整的描述和历史命名。此外，当报告来自外来组织或基因组测序的结果或偶尔非常大的疾病靶向小组时，将突变分组成类别，例如“具有与报告的表型的建立的关联的疾病基因中的突变”，“具有可能的结合的疾病基因中的突变与“报告的表型”和（如适用）“偶然（次要）调查结果”可能是有益的。解释解释应包含支持变异分类的证据，包括其对所得蛋白质的预测影响，以及所鉴定的任何突变是否可能完全或部分地解释患者的测试指标。 该报告还应向临床医生提供有关补充临床测试的任

49、何建议，例如患者细胞的酶促功能测试和家族成员的突变测试，以进一步通知变异解释。 解释部分应涉及结果部分中描述的所有突变，但可能包含其他信息。 应该注意的是，以前是否在文献或疾病或控制数据库中报告了该突变。 引用有助于分类的参考文献应在报告结尾处讨论和列出。解释部分中描述的附加信息可能包括计算机分析和进化保护分析结果的总结。 然而，可能由于医生不熟悉预测算法限制造成误解，因此应该避免人为的计算预测（例如分数，诸如“损害性”这样的术语）（参见上面的Silico Predictive Programs）。 最后报告中应列入有关疾病的外显率和可变表达能力的讨论，如果有关的话。 如何在临床报告中描述变异

50、分类的证据的示例见附录附录S1在线。方法报告中应提供通过实验进行突变检测的方法和类型，以及那些难以检测的突变。还应报告提及用于检测突变的方法的限制。方法应包括用于获得核酸（例如，聚合酶链式反应，捕获，全基因组扩增）的那些以及分析核酸的那些（例如，双向Sanger测序，下一代测序，染色体微阵列，基因分型技术）因为这可能会为保健提供者提供必要的信息，以决定是否需要额外的测试来跟踪结果。方法部分还应提供人类基因组组织基因命名委员会批准的官方基因名称，转录本的RefSeq登录号和基因组构建，包括版本。对于大型面板，基因级信息可能会被URL发布和引用。实验室可以选择添加免责声明，解决实验室测试中的一般缺

51、陷，如样品质量和样品混合。获得患者权益保护组织同意，临床试验和研究虽然不建议通过实验室报告给患者提供具体的临床指导，但为结果类别（例如所有阳性）提供一般信息是适当且有帮助的。 现在有大量的病人权益组织和临床试验可用于支持和治疗许多疾病。 实验室可以选择将该信息添加到报告的正文或附加信息，以便将其发送给卫生保健提供者，以及当突变的效果被归类为“不确定”时，报告实验室可能会努力将保健提供者连接到研究具体疾病的研究小组，只要符合健康保险便携性和责任法案，患者隐私权要求得到遵守。突变再分析随着突变的证据发展，以前的分类可能需要修改。例如，大量人群中变异频率数据的可用性导致许多不确定的重要变异被重新分类

52、为良性，并且检测其他家庭成员可能导致突变的重新分类。随着测序检测的内容扩大，识别的变异数量增加，从外显子和基因组测序扩展到成千上万的突变，实验室更新报告为变异型知识变化的能力将无法维持，因为没有适当的机制和资源来维持更新。为了对卫生保健提供者和患者设定适当的期望，实验室应对遗传检测数据的再分析提供明确的政策，以及是否可能需要进行再分析的附加费用。鼓励实验室探索创新方法，使患者和提供者更有效地获取更新的信息。37,38对于包含与主要指征相关基因不确定意义的突变的报告，以及在没有实验室主动提供的更新的情况下，建议实验室建议卫生保健提供者定期查询是否知道任何突变具有不确定性的意义，包括报告为可能致病

53、的突变，是否已经发生变化。 相反，鼓励实验室考虑对病例进行主动修正，当报告有近似分类（病原性或良性）的突变必须重新分类时。 关于医师的责任，请参阅ACMG指导方针，重新开展责任。39结果确认关于报告的突变结果的确认建议在其他地方被进行.35,36。除了所指出的，对于被认为是孟德尔病症的致病性或可能致病性的所有序列突变，推荐使用正交方法的确认研究。 这些方法可以包括但不限于样品的再次提取和检测，亲本的检测，限制酶消化，第二次对感兴趣的区域进行测序，或使用替代的基因分型技术。特别考虑根据测试指标对GUS中的突变进行评估和报告基因组和外显子测序正在鉴定新的基因型 - 表型联系。当实验室发现基因中的突

54、变没有与患者表型的有效关联时，它被定义为GUS。当基因从未与任何患者表型相关联或当基因与正在考虑的基因已经与不同表型相关联时，可能发生这种情况。将建议的指导原则应用于GUS时，必须格外小心。在这种情况下，利用针对公认的基因型 - 表型关联开发的突变分类规则是不合适的。例如，当跨越外显子或基因组时，从头观察不再是致病性的强有力证据，因为预期所有个体在其外显子中具有大约一个从头突变或在其基因组中具有约100个突变。同样，跨基因组的成千上万个变异体可以以有效的对数（LOD）得分分离。此外，可以检测到对基因或其所得蛋白明确破坏的许多有害突变（无义，移码，标准±1,2剪接位点，外显子缺失）;然

55、而，这在任何给定的疾病表现中没有足够的证据证明其起因作用。GUS中发现的突变可能被认为是候选物，并被报告为“不确定因素基因中的突变”。如果被报告，这些突变应该总是被归类为不确定的意义。 在基因本身的任何突变可被认为是该疾病的致病原因之前，需要额外的证据来支持该基因与疾病的关联。例如，在相同基因中具有匹配的罕见表型和有害突变的其他病例将使单个突变能够，可根据本文提出的建议进行分类。评估个体健康的突变或偶然性发现在使用这些指南来评估健康或无症状个体的突变或解释与主要指标无关的偶然发现时，必须谨慎行事。 在这些情况下，任何鉴定的突变是致病性的可能性可能远远低于进行疾病靶向检测时的可能性。 因此，称为

56、变异致病性的必要证据应更高，并应特别小心。 此外，在没有表型或家族史的情况下发现的病原性变异体的预测外显率可能远低于根据确定为具有疾病的患者的历史数据预测的外显率。线粒体突变除了成熟的致病性突变以外的线粒体突变的解释是复杂的，并且仍然具有挑战性; 这里有几个特殊的考虑。线粒体基因命名与细胞核基因的命名不同，应使用m.编号（例如，m.8993T> C）和p.编号，而不是标准c.编号（参见命名法）。 目前接受的参考序列是人线粒体DNA的修订剑桥参考序列：GenBank序列NC_012920gi：251831106。40，41应报告异质性或同源性，以及该突变的异质性估计值，如果确定异质性水平的

57、检测已被验证。不同组织类型的异质性百分比可能与测试样品不同;因此，低的异质性水平也必须在所测试的组织的背景下解释，并且它们可能仅在受影响的组织例如肌肉中有意义。已经记录了超过275种与疾病有关的线粒体DNA突变（/bin/view.pl/MITOMAP/ WebHome）.42 。MitoMap被认为是与线粒体突变和单元型相关的主要信息来源。其他资源，例如频率信息（http：/ www。mtdb.igp.uu.se/),43二级结构，序列和线粒体转移RNA的比对（http：/ mamittrna。u-strasbg.fr/），44线粒体单倍体（http：/ w

58、/)45和其他信息（http：/ / default.aspx），46可能证明在解释线粒体变异中是有用的。鉴于评估线粒体变异的难度，尚未包含单独的证据清单。但是，任何证据都需要加以注意（对于审查，参见参考文献47）。线粒体基因中的基因编码转移RNA以及蛋白质;因此，评估氨基酸变化仅与编码蛋白质的基因相关。类似地，由于许多线粒体突变是错义突变，缺失突变的证据标准可能不会有帮助。因为缺失突变在大多数线粒体基因中不符合已知的变异谱，所以它们的意义可能是不确定的。虽然线粒体突变通常是母体遗传的，但它们可能是零星的，但是由于异质

59、性可能低于测定的检测水平或组织之间的差异，因此难以评估从头突变。异质性水平可能有助于家族内发生的变异表达和减少的外显率。然而，异质性和疾病严重程度的百分比之间仍然缺乏相关性。47肌肉，肝脏或尿液可能是可用于临床评估的额外标本。 未检测到的异质性也可能影响病例，病例对照和家族一致性研究的结果。 此外，功能研究不容易获得，尽管评估肌肉形态可能是有帮助的（即，存在粗糙的红色纤维）。 显示因果关系的频率数据和已发表的研究可能通常是清单上唯一可评估的标准。 线粒体疾病的另一种工具可能是单体组分析，但这可能不代表临床实验室使用的常规方法，临床相关性不易解释。应考虑测试与线粒体疾病相关的核基因，因为核基因中的突变可能是氧化性疾病或调节线粒体变异的原因。药物基因组学在与药物代谢相关的基因中建立突变