分子生物学实验讲义

1、分子生物学实验讲 义生命科学学院实验一 质粒DNA的提取和酶切鉴定（6学时）一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术和方法。二、实验原理基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备以下条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量繁殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别和切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗氨苄青霉素

2、和四环素的基因，常用Ampr和Tcr表示，以此知道它是否进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其它细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程常用的载体之一。质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1-200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。所用分离质粒的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 碱裂法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线状染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在PH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合质

3、粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链仍然彼此相互盘绕，紧密结合在一起。当加入PH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复PH至中性时，质粒DNA复性准确而迅速，而线性染色体DNA由于两条链已彼此完全解开，复性就不会那么迅速准确，它们盘绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA以及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。这种酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片断。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。D

4、NA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子的大小和构型。具有不同分子量的DNA片断泳动速度不一样，可以分离。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同但构型不同的DNA。在细胞内，共价闭合环状DNA以超螺旋形式存在。如果两条链中的一条断裂发生一处或多出断裂，叫开环DNA；如果两条链同时断裂，则为线性DNA。这三种构型的质粒DNA分子在凝胶中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线性DNA，最慢的为开环质粒DNA。

5、三、实验用品:（一）器材：恒温摇床、离心机、高压灭菌锅（二）药品：葡萄糖、三羟基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钾、冰乙酸、氯仿、乙醇、酚、盐酸、含PUC19的大肠杆菌、PUC19质粒、琼脂糖、溴酚兰、蔗糖、溴化乙锭、硼酸（三）试剂：溶液 50mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L Tris-HCL(PH8.0) 1O mmol/L EDTA(PH8.0)溶液 0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混匀溶液 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 蒸馏水 28.5 mlTE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCL 1

6、0 mmol/L EDTA70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）5×TBE 配制1000mL 5×TBE Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/LEDTA 20ml凝胶加样缓冲液（6×）溴酚兰 0.25% 蔗糖 40% 溴化乙锭溶液 0.5g/mL四、实验步骤（一）培养细菌及质粒的提取1.培养细菌将带有PUC19质粒的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37培养12-18小时。（LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCL10g,用5mol/L NaOH调PH至7.5。）2从菌落中提取质粒DNA取细菌培养液1.5mL置离心管中，

7、10000r/min离心1min，去上清，如量少可重复一次。在沉淀中加入150L溶液，充分混匀，室温下放置10min.1)加入200L新配制的溶液，混匀。冰上放置5min。SDS使细胞壁破裂，并使蛋白变性。2)加入150L冰冷的乙酸钾。混匀，冰上放置15min。乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白的复合物。3)10000 r/min离心5min，上清液倒入另一干净的离心管中。4)向上清液中加入等体积的酚/氯仿（1：1，V/V）混匀，10000 r/min离心2min，将上清转移到新的离心管中。5)上清液中加入两倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，10000 r/min离心5min，倒去上清液，

8、把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。6)加0.5mL70%乙醇，混匀，10000 r/min离心2min，室温自然干燥，可放在-20保存。7)将质粒DNA溶于20L TE缓冲液，加4L凝胶加样缓冲液。（取8L点样）。（二）质粒DNA酶切及分离鉴定1.制备琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30mL 0.5×TBE缓冲液，置水浴中加热至融化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。2.板的制作1）取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用透明胶将有机玻璃内槽两端封好。2）将内槽放于水平位置，并放好梳子。3）将冷却到60左右的琼脂糖凝胶，缓慢倒入内槽，注意不要形成气泡。4）胶凝固后取出梳子，取下

9、透明胶，内槽放入电泳槽内。5）加入电极缓冲液（1×TBE）3.点样按下表加入样品。表1 DNA酶解加样表 编号试剂123样品市售PUC19质粒/L3自提质粒/L88内切酶EcoRI/L1酶解缓冲液EcoRI缓冲液/L111水灭菌水16总体积/L1010104.电泳1）接通电源（注意正负极，DNA片断从负极向正极移动），电压调到最大100V.2）当溴酚兰燃料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。5.染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染液中，染色后观察。实验二 感受态细菌的制备与质粒DNA的转化（3学时）一、实验目的 学习掌握氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞，以及质粒转化的方法。二、实验原理转

10、化指外源性DNA被宿主细胞摄取以实现遗传物质转移的过程，能摄取外源DNA的细胞称为感受态细胞。被转化的细胞称为转化体，而被摄取的DNA称为转化 因子。转化 因子不同，转化能力也不同。感受太细菌可以通过物理或化学方法来制备。物理方法是通过电击使细胞膜的通透性发生暂时性的改变而使DNA分子导入细胞；化学方法是通过一些金属离子细菌细胞膜的通透性发生改变，通常采用CaCl2 处理细菌使其成为感受态细菌：用冰冷的CaCl2溶液处理细菌后，作短暂加热。可使细菌细胞膜的通透性发生改变。即受体细胞产生“感受态”在此期间它们能摄取各种不同来源的DNA，通过这种方法可以用质粒DNA转化细胞。三、实验用品1.LB液

11、体培养基 200 ml2.50mM的CaCl2附：LB液体培养基配方： 胰蛋白胨（tryptone） 2g酵母提取物（Yeast extract） 1g氯化钠（NaCl） 1g 加H2O至 200ml琼脂 2.8 g LB固体培养基：（浓度1.4%）四、实验步骤（一）感受态细菌的制备1取37°C培养过夜的细菌40ul加入到4ml的LB液体培养基中，于37°C摇床，220转/分培养2.5小时。2培养好的细菌1500转/分离心10分钟，弃上清，留取细菌沉淀。3在细菌沉淀中加入预冷的50mM的CaCL2 1ml ，指弹法打匀，冰上放置15分钟。4再次1500转/分，离心10分钟，

12、弃上清液。5再向沉淀中加入200l 预冷的CaCL2溶液，混匀（在冰上操作），此为感受态细胞。（二）质粒的转化1在200l感受态细胞中加入5l pUC19质粒，混匀后冰上放置30分钟。2立即放42°C水浴中热休克90秒，再放冰上12分钟。3快速加入800l 的液体 LB培养基，轻轻摇均，37°C温育1小时。4温育结束，铺平皿。每管铺2个平皿，既含氨苄青酶素Amp（浓度为6mg/ml）和不含氨苄青酶素两种平皿，在平皿上做好标记，混匀后室温放置15分钟。5将200l感受态细胞涂在含有Amp的平板培养基上。637培养箱中倒置培养12-16小时后出现转化菌落。五、思考题1.说明质粒

13、的种类。2.制备感受态细胞的方法有哪些？实验三 DNA重组（6学时）一、实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。二、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接

14、的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即1216，连接12

15、16 h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其肽链的DNA序列，此结构称为lac Z基因。Lac Z基因编码的肽链是半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。Lac Z基因编码的肽链与失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为互补。由互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴

16、-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z中的多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能形成有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。三、实验用品（一）仪器恒温摇床、 恒温水浴器、

17、 恒温培养箱、 台式离心机、 超净工作台、培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等（二）材料1.胰蛋白胨2.酵母提取物3.氯化钠（NaCl）4.氨苄青霉素溶液：25mg/ml5.氯化钙（CaCl2）6.二甲基甲酰胺7.Eco RI酶及Buffer8.T4 DNA连接酶及Buffer9.大肠杆菌DH510.DNA11.pUC19质粒（三）试剂1、 3mol/l KAc（pH4.8）2、 X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20。3、 IPTG：取2g IPTG溶于8ml双蒸水中，再用双蒸水补至10ml，用0.22m滤膜过

18、滤除菌，每份1ml，贮存于-20。四、实验步骤1、质粒及目的DNA的酶切在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒2L（2g/L），2L酶切缓冲液，1L Eco RI酶，无菌双蒸水15L，至反应混合物总体积为20L。离心混匀，37反应2h（酶及缓冲液应放在冰上）。在另一无菌Eppendorf管中，加DNA 1.5g，加入1L酶切缓冲液，1L Eco RI 酶，无菌双蒸水补到10L，37反应2 h。（反应完毕后，各取2L酶解液做电泳分析。）2、酶切产物的纯化分别将余下的酶解液加入1/10体积的3 mol/L KAc（pH 4.8）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20冰箱，1h（沉淀 DN

19、A）。12000 r/min 4 离心15 min，弃上清，室温干燥后，加5L TE溶液。3、载体与插入片段的连接将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1L，T4DNA连接酶1L，20保温2h。4、细胞转化 a）200L感受态细胞加入连接产物8L，轻轻混匀，冰上放置30min。做两个对照管： 受体菌对照：200L感受态细胞悬液+2L无菌水 质粒对照：200L 0.1mol/LCaCl2溶液+2LpUC19质粒溶液b）42水浴90s。c）冰浴2min。d）加入200L LB液体培养基，37摇床摇振30min。5、结果检查a）制备含有氨苄青霉素琼脂平板（终浓度50g/mL）

20、。b）加入X-gal 40L，IPTG 4L，均匀涂布。c）取200L菌液铺在平板上。d）37倒置培养12-16h，可观察到菌落。e）4将平板放置1h，使蓝色充分显现。实验四 植物基因组DNA的提取（6学时）一、实验目的掌握植物基因组DNA的抽提方法和基本原理。二、实验原理DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤

21、其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去

22、细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验用品（一）材料植物叶片（二）试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、乙醇、十二烷基硫酸钠（SDS）、-巯基乙醇、琼脂糖、异丙醇。1.细胞提取液：100mmol/L Tris·HCl（pH8.0）5 mmol/L EDTA（pH8.0）500 mmol/L NaCl1.25% SDS1mol/L -巯基乙醇2.5mol/L KCl3.TE缓冲液四、实验步骤1、取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状。2、转移至

23、50ml离心管中，加入16ml细胞提取液，充分混匀，65水浴保温20min。3、从水浴中取出离心管，加入5ml 5mol/L KCl溶液，混匀，冰浴20min。4、4000r/min离心20min。5、将上清液转移到另一50ml离心管中。6、加等体积酚/氯仿混匀，12000r/min离心5min，取上清。7、加等体积氯仿混匀，12000r/min离心5min，取上清。8、加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。9、离心获得沉淀，70%乙醇洗3次，风干沉淀。10、加入500 TE缓冲液，溶解DNA。11、取3L上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。五、 注意事项 （1）叶片磨得越

24、细越好。 （2）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。实验五 基因扩增及检测技术PCR技术（6学时）一、实验目的 学习PCR反应的基本原理与实验技术。掌握PCR扩增仪的使用方法和原理。二、实验原理聚合酶链反应（简称PCR）技术是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称无细胞分子克隆技术。是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。其特异性取决于引物核模板DNA结合的特异

25、性。PCR过程包括三个基本步骤：即双链DNA加热变性；在一定温度下引物与单链模板DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。重复上述三种步骤可以使特异DNA片段扩增数百万倍。 由于它简单、快速、特异和灵敏的特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erlich发现耐高温DNA聚合酶以来，短短的几年间，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传病学、法医学、动植物免疫学等方面取得了令世人瞩目的成就，成为当代分子生物学发展史上的里程碑。三、实验用品1模板DNA：用1l菌悬液做模板。2. 引物：由公司合成DNA引物，配成20 pmol/l 溶液，分装后4和-20保存。3.dNTP：配制成2mmol/L储备液，分装后-20保存。4.Taq酶：终浓度为2-2.5U/100l5.10×PCR缓冲液6.琼脂糖7.溴化乙锭（EB）四、实验步骤1.细菌培养：将大肠杆菌接种于LB液体培养基，37振荡过夜，菌液4保存备用。2.PCR反应体系：（50l）在0.2ml离心管中加入以下药品：10×PCR缓冲液 5ldNTP 各1l引物1 1l引物2 1l模板DNA 1l（0.1-1ng）Taq酶（2U/100l