分子生物基本试验技术

1、组织细胞培养细胞传代1 去除原有培养液2 PBS洗一遍3 胰蛋白酶消化,37,1-2分钟4 加入新鲜的培养液，吹打至细胞分散，剩余一定比例的细胞悬液，加入一定量的新鲜培养液。5 CO2温箱37培养冻存细胞1 去除原有培养液2 PBS洗一遍3 胰蛋白酶消化,37,1-2分钟4 加入新鲜的培养液，吹打至细胞分散，收集细胞悬液至离心管中5 离心，2000rpm，2分钟6 去除上清，加入新鲜的培养液（10%DMSO+20%FBS）解冻复苏细胞1 将冻存细胞置于37水浴中，<1分钟2 用70%酒精消毒管口3 将细胞溶液用20ml培养液稀释4 离心，2000rpm，2分钟5 去除上清，加入新鲜的培养

2、液细胞转染Dhamafect1(DHARMACON)转染*细胞密度：96孔板：1*104/孔，12孔板：1*105/孔，10CM盘：1*106/孔SiRNA终浓度：50-100nM12孔板1 SiRNA(20M )2.5l/孔+去血清培养液，混匀于室温下静置5分钟2 Dhamafect1试剂2l/孔+去血清培养液，混匀于室温下静置5分钟3 将100l SiRNA混液与100l Dhamafect1试剂混液充分混合成转染液，室温下静置20分钟4 将200l转染液加入800l正常培养液中。5 去除细胞旧的培养液，加入含有转染液的新的培养液CO2温箱37孵育24-48h。Western Blot收细

3、胞1 去除原有培养液2 PBS洗一至两遍3 根据细胞密度加入适量的溶胞试剂（lysis buffer）*12孔板每孔加40-60ul4 刮去细胞溶液，收集在1.5ml离心管中5 超声打碎细胞溶液10-20秒（Sonicate,Sonic Dismembrator）6 4摄氏度离心13000rbm，8-10分钟7 取上清即可蛋白定量*标准样品（2mg/ml）配成80，40，20，10，5，2.5ug/100ul*BCA蛋白分析试剂，A:B=50:1,100ul/well*96孔板，细胞裂解液5-10ul+H2O90-95ul1加入样品和BCA试剂后，37摄氏度，30分钟2用ELISA仪测吸光度（

4、OD值），参照标准样品浓度得出样品浓度。电泳*凝胶浓度：分子量越大浓度越低*缓冲液：Tris-Hepes-SDS Running Buffer*加样前用1ml洗头吹打加样槽，驱赶气泡*加样时不可将吸头进入过多，以免凝胶分离*加样缓慢，以避免气泡将样品顶出1根据样品蛋白定量，以最小浓度计算所需提及，并加入loading缓冲液，100摄氏度加热5-10分钟（总体积小于等于60ul）2电泳，100v，50-60分钟转膜三明治：从负极到正极依次是：海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵22v过夜，60v四小时缓冲液：封闭缓冲液：5%脱脂牛奶/5%小牛血清TBST40-60分钟室温下轻摇加入一抗1：1000，

5、4摄氏度，轻摇过夜TBST洗三次，每次10-15分钟加入二抗1：3000，室温一小时轻摇TBST洗三次，每次10-15分钟曝光免疫沉淀*Affinity Gel140ul/样品 Affinity Gel悬液，用500ul冰PBS洗两遍，离心后去除上清2加入约含1000ug蛋白的细胞裂解液，用水使体积达1ml34摄氏度旋转混匀过夜44摄氏度离心，13000rbm，去除上清，冰500ul冰PBS洗两遍，离心后去除上清5加入loading缓冲液80ul/管， 100摄氏度加热三分钟64摄氏度离心，13000rbm，取上清至新的离心管7做Western Blot96孔板XTT1 细胞密度：1000/孔

6、，次日加药，24，48，96h行XTT2 A50ul/well+B1ul/well+培养液100ul/well,37摄氏度4小时3 492nm光谱，测od值免疫组化（96孔板）1 待测细胞，PBS洗两遍，每次5分钟，用4%paraformoldehyde(溶于PBS)室温孵育十分钟2 PBS洗两遍，每次5分钟，3 用1%H2O2室温孵育10-15分钟4 PBS洗两遍，每次5分钟5 PBST（PBS+0.1%Triton X-100）洗一遍，5-10分钟6 用Diluted Normal Horse Serum(NHS)孵育20分钟封闭7 加入一抗1：100溶于上封闭液中，4摄氏度孵育过夜8 去

7、除一抗溶液，PBS洗三遍，每次5分钟9 用Diluted Biotinylated “universal”Secondary Ab室温孵育30分钟10 PBS洗三遍，每次5分钟11 用ABC试剂室温孵育30分钟12 PBS洗一遍，5分钟13 加入底物（30ul ImmuPACT DAB+1ml Diluent Vector Lab ImmuPACT DAB Peroxidase Substrate）2-10f分钟，用水洗5分钟，显微镜观察免疫荧光（96孔板）1 待测细胞，PBS洗两遍，每次5分钟，用4%paraformoldehyde(溶于PBS)室温孵育十分钟2 PBS洗两遍，每次5分钟，3

8、 PBST（PBS+0.1%Triton X-100）洗一遍，5-10分钟4 用Diluted Normal Horse Serum(NHS)孵育20分钟封闭5 加入一抗1：100溶于上封闭液中，4摄氏度孵育过夜6 去除一抗溶液，PBS洗三遍，每次5分钟7 用FITC-labeled 二抗（1：200）（溶于原封闭液中），孵育45-60分钟，室温下。8 PBS洗三遍，每次5分钟9 加入VECTASHIELD mounting medium分子生物学实验技术质粒扩增1 将感受态细菌细胞解冻，20-25ul/离心管（1.5ml）2 加入1ug质粒，混匀，冰上静置10分钟以上3 42摄氏度热休克20-40秒4 再次置于冰上2分钟5 加入200ul的LB培养液，37摄氏度，225转摇30-60分钟6 用吸头沾少许在LB培养盘上快速滑