LSP1基因多态性与膀胱癌的关联分析及LSP1在膀胱癌中的表达及意义

1、LSP1基因多态性与膀胱癌的关联分析及LSP1在膀胱癌中的表达及意义第一部分 :LSP1 基因多态性 rs907611 与膀胱癌的相关性分析目的: 研究白细胞特异性蛋白 1(Leukocyte-specific protein 1,LSP1)单核苷酸多态性rs907611 与天津地区汉族人群膀胱尿路上皮癌发病风险的相关性。方法: 收集2012 年 5 月至 2014 年 6 月在天津医科大学第二医院初次确诊的535 例膀胱尿路上皮癌患者的血液及649 例对照组人群 ( 与病例组年龄、性别相匹配的正常体检人群 ) 的血液进行研究 , 提取全血基因组DNA,应用 PCR-LDR方法进行基因分型。首

2、先检验分型结果是否遵循HWE平衡定律 , 然后采用多因素非条件logistic回归检验来分析 rs907611 基因型与天津汉族人群膀胱癌易感性、分期、分级、吸烟及进展风险的相关性 ; 应用 Kaplan-Meier曲线和 COX回归模型来分析rs907611基因型与膀胱癌短期复发的相关性。结果 : 分型结果符合 HWE平衡定律 (p>0.05)。LSP1 rs907611 存在三种基因型 : 野生型 (G/G) 、突变杂合子 (G/A) 及突变纯合子 (A/A) 。以野生型 (G/G) 基因型为对照 , 突变纯合子 (A/A) 人群膀胱癌发病风险明显提高(p=0.036,OR=

3、1.786,95%CI 1.038-3.072),突变型 (G/A+A/A) 人群中膀胱癌的发病风险也有轻微升高 (p=0.049,OR=1.264,95%CI 1.001-1.596);与 G等位基因相比 ,A 等位基因与膀胱癌的发病风险存在明显的相关性(p=0.019,OR=1.264,95%CI1.038-1.538)。分层分析结果显示rs907611 与膀胱癌分期分级的发病风险没有明显的相关性。另外 , 结果显示 rs907611 对吸烟人群膀胱癌的发病风险没有影响。结合随访数据进行分析 , 没有发现这 rs907611 与非肌层浸润性膀胱癌的短期复发存在相关性。结论 :LSP1 基因

4、 rs907611 位点基因突变可显著增加天津地区汉族人群膀胱癌的发病风险 , 尤其与低级别、非肌层浸润性膀胱癌的发生关系密切。这一基因并不会影响吸烟患者膀胱癌的发病率, 也与天津地区汉族人群膀胱癌的短期复发没有显著地相关性。 第二部分 : 膀胱癌易感位点LSP1rs907611 的功能分析目的 :通过研究 rs907611 多态性位点周围基因的表达量与rs907611 基因型的相关性来筛选单核苷酸多态性rs907611 的靶基因 , 从而进一步探讨 rs907611 增加膀胱癌易感性的作用机制。方法 : 在 UCSC Genome Browser中检索 rs907611 位点两侧各 250k

5、bp 范围内的基因 ( 包括 DNA、microRNA和 lincRNA) 。从我实验室膀胱癌标本库中随机选择与 rs907611 的三种基因型相对应的患者的膀胱癌及癌旁组织标本共24 对, 其中G/G基因型 10 对、 G/A 及 A/A 基因型各 7 对, 提取组织 RNA,应用实时定量 Q-PCR的方法检测相应基因的表达情况。结果: 在 rs907611 两侧 500kbp 范围内共存在21 个基因 , 其中 DNA包括 KRTAP5-3、KRTAP5-4、KRTAP5-5、KRTAP5-6、IFITM10、SYT8、TNNI2、LSP1、CTSD、TNNT3、HOTS和 MRPL23;

6、microRNA包括 MIR4298、MIR7847和 MIR675;lincRNA 包括 MRPL23-AS1、FAM99A、FAM99B、 H19、Linc01219 及Linc01150 。Q-PCR结果显示以上所有基因的表达量与rs907611 的基因型均没有明显的相关性 (p>0.05);但是我们发现癌组织中LSP1及 MIR7847的表达量明显低于癌旁组织 (p<0.05),癌组织中 H19和 MIR675的表达量明显高于癌旁组织(p<0.05)。结论 : 在 LSP1基因多态性 rs907611 位点周围 500kbp 范围内没有rs90

7、7611 的靶基因 ;LSP1 及 MIR7847在癌组织中明显低表达 , 而 H19和 MIR675在膀胱癌组织中明显高表达。第三部分:LSP1 在膀胱癌中的表达及意义目的: 研究 LSP1在膀胱癌中的表达水平 , 并初步探讨 LSP1对膀胱癌细胞的影响。方法 : 应用免疫组化和 western-blot 技术检测膀胱癌组织及癌旁正常膀胱黏膜 LSP1的表达情况。构建 LSP1过表达质粒 , 转染 T24膀胱癌细胞 , 应用 Q-PCR、Western-blot检测转染效果 , 应用 MTT、流式细胞术、划痕实验及Transwell实验检测 LSP1对膀胱癌细胞的增殖、 凋亡、迁移及侵袭的影响。 结果 : 免疫组化和Western-blot结果显示 LSP1在膀胱癌组织中明显低表达。我们成功构建 pcDNA3.1(+)/LSP1 过表达质粒并顺利转染T24 膀胱癌细胞 ;MTT结果显示转染 LSP1过表达质粒后 T24 细胞的增殖受到明显的抑制 ; 流式细胞术结果显示出 T24 细胞中 LSP1过表达后细胞凋亡明显增加 ; 划