转铁蛋白修饰的喜树碱树技状高分子复合物的药动学研究

1、转铁蛋白修饰的喜树碱-树技状高分子复合物的药动学研究 基金项目：国家自然科学基金（30672543），上海市科委基础重点项目（10JC1402202）唐国涛1,2 作者简介：唐国涛，男，博士，讲师，研究方向：靶向给药系统的研究，药物制剂制备工艺及质量标准的研究。Tel: E-mail: * 通讯作者：姜嫣嫣，女，博士，副教授，主要研究方向：肿瘤靶向传释系统的应用基础研究和药物新剂型和新技术应用开发研究。Tel: Email: ，朱赛杰1，洪鸣凰1，姜嫣嫣1*，裴元英1（1复旦大学药学院药剂学教研室，智能化递药教育部和全军重点实验室，上海，201203；2南华大学药学与生命科学学院药学系，湖南衡

2、阳，421001）摘要：目的探讨转铁蛋白修饰的主动靶向纳米载药复合物在大鼠体内的药动学行为。方法碱水解后采用HPLC法测定大鼠尾静脉给药后血浆中的药物浓度。结果经转铁蛋白修饰的主动靶向复合物能显著提高喜树碱在大鼠体内的半衰期及平均滞留时间，比未经转铁蛋白修饰的载药复合物的半衰期的平均滞留时间短。结论转铁蛋白-聚乙二醇-聚酰胺-胺树枝状分子-喜树碱复合物具有显著的长循环效果。关键词：聚酰胺-胺树枝状聚合物；转铁蛋白；聚乙二醇；喜树碱；药动学中图分类号：R969.1，R285.6文献标识码：A文章编号：Study on tumor active targeting with Transferrin

3、-PEG-PAMAM dendrimer-CPT conjugateTang Guotao1, Zhu Saijie2, Hong Minghuang2, Jiang Yanyan2*, Pei Yuanying2（1 Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan Univeristy, Shanghai, 201203; 2Department of Pharmacy, School of pharmacy and Life Science, Nanhua Univeristy, Hengyang, Hunan, 421001）

4、Abstract: Objective To explore the pharmacokinetics characteristic of transferrin modified PEGylated polyamidoamine dendrimers (PEG-PAMAM) as the carrier for tumor targeting of the anticancer drug camptothecin(CPT) in rats. Method CPT solution and PEG-PAMAM-CPT as control, transferrin modified PEG-P

5、AMAM-CPT was injected via the tail vein. The plasma concentration of CPT in rats was determined by HPLC following alkaline hydrolysis. Results Transferrin modified PAMAM-PEG-CPT could enhance half-life and mean residence time comparing with that of CPT solution, but were relative shorter than that o

6、f CPT-PAMAM-PEG. Conclusion Transferrin modified PAMAM-PEG-CPT had a better long-circulating effect in rats.Keywords: Poly(amidoamine) Dendrimer; Transferrin; Poly(ethylene glycol); Camptothecin; Pharmacokinetics喜树碱（camptothecin, CPT）是上世纪60年代从中国喜树中提取的同类抗肿瘤单体中抗癌作用最强的微量生物碱1，系统的药理研究表明其抗癌机理为抑制DNA拓扑异构酶（T

7、opo）2。半衰期短（30 min左右）；脂、水溶性不好；E环内酯环对光、pH敏感，开环后丧失药理活性，毒副作用大，这些缺点限制了其临床应用。为提高喜树碱的溶解度和内酯环稳定性、延长血中循环时间以及降低毒副作用，本实验制备了以聚酰胺-胺树枝状聚合物（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）为载体，转铁蛋白（Transferrin，Tf）为靶向头基的主动靶向给药系统。将CPT共价连接在材料上，可提高药物的溶解性，且CPT结构中20S位经酯键连接后可提高药物稳定性，材料经聚乙二醇修饰后可提高药物在体内的半衰期，以Tf修饰后可提高药物在肿瘤部位的浓度。本文以CPT溶液及未经靶向

8、头基修饰的复合物为参比，考察尾静脉注射后大鼠体内的药动学过程，为肿瘤主动靶向给药系统的研究提供研究基础。1材料与方法1.1主要仪器岛津LC-10AT高效液相色谱仪，SPD-10A检测器（日本岛津），HSG2000色谱数据工作站（杭州英谱），Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪（英国马尔文），冷冻干燥机（Christ Alpha 2-4，GermanyXW-80A），蜗旋混合器（上海医大仪器厂），TGL-16C飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2主要试剂第4代PAMAM（Mr =14215，美国Dendritech），NHS-PEG-MAL （Mr = 3500，北京键凯），喜树碱

9、（上海骏杰），肝素钠粉末（上海冠亚科技发展有限公司），色谱级甲醇和乙腈（美国Tedia），其他试剂均为分析纯。1.3实验动物Sprague-Dawley雄性大鼠，体重（200±20）g（上海斯莱克实验动物有限责任公司），昆明种雄性小鼠，体重（20±2）g（上海实验动物中心）。1.4 复合物的制备CPT-PAMAM-PEG-Tf的结构见Fig 1，首先将PEG活化的羧基端与PAMAM表面的氨基共价连接，制备了3种不同PEG化程度的PAMAM-PEG复合物，按照PEG与PMAM的投料比分别称为PP16，PP32和PP48，以丁二酸酐为连接剂，将CPT与PAMAM表面剩余的氨基连

10、接，得到载CPT的PAMAM-PEG复合物，分别称为CPP16，CPP32和CPP48；最后将巯基化的Tf与PEG外端的马来酰亚胺共价连接，分离后得到具主动靶向头基的载药复合物，分别称为CPP16T，CPP32T和CPP48T。图1CPT-PAMAM-PEG-Tf的结构Fig. 1Structure of CPT-PAMAM-PEG-Tf1.5喜树碱复合物的药动学研究1.5.1色谱条件色谱柱：Thermo Scientific ODS-2 Hypersil 150×4.6，流动相：甲醇水 5050，流速：1.0 mL·min-1，柱温：室温，检测波长：365 nm，进样量：

11、20L。1.5.2血浆样品处理方法测定血浆样品中游离CPT的处理方法：大鼠血浆100L，加0.1moL·min-1 HCl 100L，混匀，加甲醇200L，漩涡1 min, 12000 rpm离心10 min，取上清液20L HPLC测定。测定血浆样品中总CPT的处理方法：取大鼠血浆100 L，加0.2 moL·L-1 NaOH 50 L，混匀，室温放置1 h，加0.5 moL·L-1 HCl 50 L，加甲醇200 L，漩涡1 min，12000 rpm离心10 min，取上清液20L HPLC测定。1.5.3标准曲线的建立CPT储备液：精密称取CPT 20mg

12、用DMSO定容至25 mL，得浓度为800g·mL-1的CPT溶液，于冰箱4保存。标准曲线：精密量取CPT储备液，用DMSO稀释得1、4、20、100、400、600 g·mL-1的标准溶液。取空白血浆90L，分别准确加入上述标准溶液10L，使血浆浓度分别为0.1、0.4、2、10、40、60g·mL-1，每个浓度配制5份，按方法操作进行血浆处理后进样。以CPT峰面积（A）对相应浓度（C）线性回归，得标准曲线方程。1.5.4供试样品的配制CPT溶液3,4：称取CPT粉末适量，溶于50 mL DMSO，PEG400，乙醇和pH3.5磷酸缓冲液的混合溶剂（比例为202

13、03030）。各复合物溶液：取各复合物适量，溶解于5 mL去离子水中，按照测定复合物中CPT含量的方法测定CPT的量，调整溶液的浓度，使与CPT溶液的浓度一致。1.5.5血药浓度分析方法的评价（1）绝对回收率取空白大鼠血浆90 L，分别加入CPT标准液、各种复合物溶液各10 L，配制高、中、低3个浓度水平的血浆样品（0.4、10、60 g·mL-1），每一浓度配制3份样品。按血浆样品处理方法进行处理后进样，分别与同浓度的CPT标准溶液直接进样的峰面积作比较，计算绝对回收率。（2）相对回收率取空白大鼠血浆90L，分别加入CPT标准液、各种复合物溶液各10L，配制高、中、低3个浓度水平的

14、血浆样品（0.4、10、60 g·mL-1），每一浓度配制3份样品。按血浆样品处理方法进行处理后进样，测定峰面积A，代入标准曲线得浓度C，按下式计算相对回收率：相对回收率测得量/理论量×100（3）检测限以信噪比S/N=3测得最低检测限为16 ng·mL-1。（4）精密度考察取空白大鼠血浆90L，分别加入CPT标准液、各种复合物溶液各10L，配制高、中、低3个浓度水平的血浆样品（0.4、10、60g·mL-1），每一浓度配制3份样品。按血浆样品处理方法操作，进行HPLC分析。一天内重复操作5次，统计测定数据的平均值和标准差，计算相对标准偏差（RSD），即

15、为日内精密度（inter-day precision）。以同样的方法连续5 d操作测定高、中、低3个浓度（n=3），统计测定数据的相对标准偏差（RSD），即为日间精密度（intra-day precision）。1.5.6给药方案与血样采集 取于温度25±2，相对湿度75±5和自然光条件下，饲养1周的SD雄性大鼠（200±20）g 35只，随机分成7组，每组5只。分别尾静脉注射，剂量为1 mg·kg-1（以CPT量计）。第1组：CPT溶液；第2、3、4组：CPP16，CPP32和CPP48复合物；第5、6、7组：CPP16T，CPP32T，CPP48T复

16、合物；静脉给药后，分别于5、15、30min、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48、72 h，眼眶取血0.5 mL，置肝素钠抗凝的离心管中，8000 r/min离心5 min后取血浆于-20保存。处理后经HPLC测定血药浓度。采用3P97软件计算药动学参数，用excel对每个时间点血药浓度进行方差分析，并进行比较。2结果2.1血药浓度测定方法的确定方法专属性空白血浆、空白血浆加一定浓度CPT溶液和给药后血浆样品按方法项下所述步骤处理后，总CPT含量测定HPLC色谱图见图2。结果表明，CPT的保留时间约为5 min。在上述色谱条件下分析，空白血浆对CPT测定无干扰。ACB图2鼠

17、血浆中总CPT 含量HPLC色谱分析（A：空白血浆，B：空白血浆加一定浓度CPT溶液，C：给药后血浆样品）Fig 2Chromatograms of CPT in rat plasma. A: blank plasma sample; B: blank plasma spiked with CPT; C: plasma sample标准曲线和线性范围以CPT的峰面积A对其浓度C（g·mL-1）进行线性回归，得方程式如下：A15939C-816.42，（r20.9999, n=5），线性范围0.160g·mL-1。2.2血药浓度分析方法的评价绝对回收率与相对回收率复合物血浆样

18、品测定方法的绝对回收率测定结果见表1。结果表明：在线性范围内所用方法的绝对回收率为80.23%86.34%。相对回收率为95.58%103.76%。表1 鼠血浆中CPT测定的准确性评价Table 1 Accuracy of the determination of CPT in rat plasma（n=3）复合物绝对回收率相对回收率低0.4g·mL-1中10g·mL-1高60g·mL-1低中高CPT80.23±2.3583.65±2.1686.34±1.67103.76±4.1599.14±2.1796.57&#

19、177;2.59CPP3280.63±4.3184.50±1.5084.98±0.72102.61±4.8197.07±1.7197.95±0.71CPP32T81.34±1.8383.40±0.7284.91±3.45103.48±2.0395.82±0.8297.87±3.37精密度精密度实验结果见表2。实验数据表明，CPT体内测定方法的日内和日间精密度良好，RSD均小于6.5，符合生物样品分析要求。表2鼠血浆CPT测定精密度评价Table 2Precision for

20、CPT assay in rat plasma（n=5）复合物日内精密度（%）日间精密度（%）低中高低中高CPT3.582.873.044.562.673.42CPP325.351.783.086.063.613.68CPP32T2.240.853.456.152.312.83喜树碱分子中的内酯环在血液中存在开环和闭环的平衡，非共价连接的纳米给药系统5在测定喜树碱血药浓度的时候可以同时测定血浆中内酯环开环和闭环的药物量。样品用3倍体积的乙腈沉淀蛋白后，加pH6.0的磷酸缓冲盐调整样品至流动相比例，同时测定样品中开环和闭环的CPT。本研究由于喜树碱与材料共价连接，在血浆中部分药物与材料仍然共价连

21、接，参考文献方法3将喜树碱从材料上水解下来，再酸化来测定血浆中总的喜树碱浓度。同时不水解复合物直接酸化样品测定血浆中游离喜树碱的浓度。2.3 大鼠体内药动学参数大鼠尾静脉注射CPT溶液，CPP16，CPP32，CPP48，CPP16T，CPP32T和CPP48T复合物后，平均血药浓度-时间曲线见图3，原料药在体内很快被清除，半小时以后血药浓度低于检测限，复合物除了CPP16以外，其余的在48h都能检测到。4 h以后，复合物的血药浓度下降趋势随PEG化程度的升高而减缓。将原料药与各复合物在大鼠血浆中的浓度数据按3P97软件的统计矩分析，结果见表3。CPP16，CPP32和CPP48的血浆半衰期分

22、别为CPT溶液的29.4，44.7和48.4倍；MRT分别为CPT的33.6、40.6和49.4倍；AUC0分别为CPT溶液的451.5、563.5和1014.0倍，表明随着PEG化程度的提高，药物在血浆中的滞留时间明显延长，药物清除减慢，从而导致AUC提高。 图3 注射CPT，CPP，CPPT各种复合物，大鼠体内平均血药浓度-时间曲线（n=6）Fig. 3 Mean plasma concentration-time curves of CPT in normal rats dosed with CPT solution, CPP and CPPT to rats (µg·

23、;mL-1) n=6表3 大鼠体内原料药与各复合物药动学参数Table 3 Pharmacokinetics parameters of HCPT injection, non-NS, PEG-NS and Tf-PEG-NS after intravenous administration to rats（±SD, n6）ParametersCPT solutionCPP16CPP32CPP48A （g·mL-1）28.56±3.629.80±1.1017.74±2.1512.66±4.85 （h-1）0.85±0.100

24、.23±0.010.16±0.010.17±0.01B （g·mL-1）1.84±0.273.56±0.395.77±0.4412.86±0.061 （h-1）2.1±0.050.077±0.0040.053±0.0040.051±0.001T1/20.33±0.039.69±0.2414.75±0.5615.96±1.36Vc （L）0.02±0.0020.056±0.0260.043±0.0030.04

25、0±0.007AUC0 （h·g·mL-1）0.26±0.01117.41±3.92146.53±3.04263.63±9.87MRT （h）0.38±0.0812.78±0.1315.44±0.7918.78±0.34CPP16TCPP32TCPP48TA （g·mL-1）9.25±0.2218.78±0.7712.86±2.44 （h-1）0.27±0.030.16±0.0010.15±0.001B （g

26、3;mL-1）15.14±5.556.21±0.597.98±0.17 （h-1）0.091±0.010.053±0.0010.051±0.001T1/27.94±0.63*13.13±0.36*13.78±0.31*Vc （L）0.043±0.0080.040±0.0010.045±0.005AUC0 （h.g·mL-1）105.38±4.27133.34±9.73199.47±6.30MRT （h）12.15±0.4713

27、.62±0.3216.35±0.77*P<0.05（与未经Tf修饰的复合物相比）经Tf修饰后的CPP16T，CPP32T和CPP48T在血浆中半衰期同样比CPT溶液有明显延长，分别为CPT溶液的24.1，39.8和41.8倍。但比对应的CPP16，CPP32和CPP48要短，分别缩短为原来的81.94%，89.02%和86.29%。MRT分别为CPT的31.9、35.8和43.0倍；AUC0分别为CPT溶液的405.4、512.7和767.3倍。3讨论树枝状大分子（Dendrimer）具有完美的多分散性和规整的三维结构。自有关树枝状大分子的报道以来，具有特殊功能和应用

28、价值的树枝状大分子逐渐引起人们的关注，聚酰胺-胺树枝状大分子（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）是目前研究最为广泛的一类树枝状大分子材料，其具有稳定、无免疫原性、在使用剂量范围内无毒性、对生物活性物质转运效率高等优点，已成为药物传释系统的研究热点之一6。PAMAM纳米微粒载药系统用PEG进行表面修饰后，可降低网状内皮系统对微粒的识别，延长半衰期，通过EPR效应浓集于肿瘤部位7,8。CPP复合物半衰期的延长是药物共价连接在材料上延缓药物释放以及PEG修饰的复合物具有减少血浆蛋白吸附、降低补体消耗、躲避巨噬细胞吞噬能力的双重作用所致。由于药物复合物在体外的释放速率一致，

29、所以复合物的消除半衰期随PEG化程度的增加而延长主要受PAMAM表面PEG的影响。连接Tf后的复合物CPP16T，CPP32T和CPP48T在血浆中半衰期和平均滞留时间比相应的CPP16，CPP32和CPP48短（P<0.05），AUC也比相应的CPP小（P<0.05）。而对于Tf修饰的脂质体9，泡囊10等主动靶向载药系统与未经Tf修饰的载药系统相比，其药动学参数并无显著性差差异，其可能原因主要是因为脂质体，泡囊等的粒径都在100 nm以上，Tf修饰后对其粒径和表面性质并无大的影响，而CPP复合物的粒径较小，经Tf修饰后其Zeta电位由正变负，对其在体内的分布有较大的影响：a）主动

30、靶向复合物中每个分子上平均连接有一个转铁蛋白分子，转铁蛋白分子量为80 KD，与未连接转铁蛋白的复合物分子量大致相当，从分子大小来看，连接上转铁蛋白使复合物粒径增加了近一倍。粒径增大（约7 nm左右），可能有利于体内单核巨噬细胞系统的摄取，在一定程度上使其消除稍有加快。b）从体内分布角度考虑：由于体内正常组织和器官也具有转铁蛋白受体，能与转铁蛋白相结合，从而导致一部分Tf修饰的复合物分布到了组织和器官中，使血浆中测得的药物量有所减少。参考文献1Li Q.Y, Zu Y.G., Shi R.Z, et al. Review Camptothecin: current perspectivesJ.

31、 Current Medicinal Chemistry, 2006, 13(17): 2021-2039.2Joseph F P, Leonard B S. The camptothecinJ. The Lancet, 2003, 361: 2235-2242.3Schluep T, Cheng J.J, Khim K. T, et al. Pharmacokenetics and biodistribution of the camptothecin-polymet conjugate IT-101 in rats and tumor-bearing miceJ. Cancer Chemo

32、theapy Pharmcology. 2006, 57: 654-662.4Lalloo A, Chao P.Y, Hu P, et al. Pharmacokinetic and pharmcodynamic evaluation of a novel in situ forming poly(ethylene glycol)-based hydrogel for the controlled delivery of the camptothecinJ. Journal of Controlled Release, 2006, 112: 333-342.5Dennis O.S, Dilbir S.B, Valentin