透明质酸紫杉醇聚电解质复合纳米粒口服给药研究

1、透明质酸紫杉醇聚电解质复合纳米粒口服给药研究目的目的口服+靶向（1）口服化疗相对于注射化疗来说具有很多优势，例如它改善了病人的依从性， 降低了设备及人力成本，促进了晚期的或转移性癌症患者的慢性治疗，口服化疗提出了一个新的化即“化疗在家里”（2）就是击中靶标，减少毒副作用内容提要内容提要肿瘤靶向简单介绍紫杉醇的药理作用聚电解质和纳米粒的简单介绍口服给药的研究制备的介绍未来的前景 肿瘤的分子靶向治疗是指利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、靶组织或靶器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减

2、少毒副作用的一种方法。定义肿瘤靶向治疗肿瘤靶向治疗v依据已知肿瘤发生中涉及的异常分子和基因，设计针对依据已知肿瘤发生中涉及的异常分子和基因，设计针对这些特定分子和基因靶点的药物，选择性杀伤肿瘤细胞。这些特定分子和基因靶点的药物，选择性杀伤肿瘤细胞。这种治疗方法称为肿瘤药物的分子靶向治疗这种治疗方法称为肿瘤药物的分子靶向治疗(Molecular targeted therapy)。 药物靶向治疗的效果取决于靶向药物的自身特性和肿瘤内是药物靶向治疗的效果取决于靶向药物的自身特性和肿瘤内是否存在靶向药物作用的分子靶点。否存在靶向药物作用的分子靶点。 只对某个器官的肿瘤有效，如肿瘤 的介入治疗、射频热

3、疗等。器官靶向：细胞靶向： 分子靶向：选择性地与这类细胞特异性地结合，从而消灭 肿瘤细胞，如I131、希罗达、脂质体阿霉素等针对肿瘤细胞特有的受体，关键基因和调控分子为 靶点的治疗（阻断信号传导通路中某一个分 子靶点）肿瘤靶向治疗的三个层次分类1、抗体免疫偶联物2、封闭类抗体药物3、作用于信号传导类药物4、效应子杀伤类药物5、抗独特性疫苗类抗体药物6、纳米技术改造的药物目前主要分子靶向药物目前主要分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（Gefitinib）、埃罗替尼（Erlotinib）、克唑替尼抗EGFR单抗西妥昔单抗（Cetuximab）、帕尼单抗（PANITUMUMAB）Bcr-Abl酪氨

4、酸激酶抑制剂伊马替尼（Imatinib）、尼洛替尼（Nilotinib）、达沙替尼（Dasatinib）抗血管内皮生长因子受体（VEGFR）的单抗贝伐单抗（Bevacizumab）抗CD20的单抗利妥昔单抗(Rituximab)IGFR-1激酶抑制剂NVP-AEW541mTOR激酶抑制剂Temsirolimus(CCI-779)、Everolimus(RAD-001)泛素-蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib）。 多靶点抑制剂舒尼替尼（Sunitini）、索拉非尼（Sorafinib）、拉帕替尼（Lapatinib）、范德他尼(Vandetanib)等由抗体和特异的效应分子连接形成作用

5、靶点 分化抗原、癌胚胎性抗原偶联物的种类 化疗药物、放射性核素、毒素代表性药物： 利妥昔单抗抗体免疫偶联物紫杉醇的各种参数紫杉醇的各种参数化学名称 : 5，20-环氧-1，2，4，7，10，13-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13（2R，3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯分 子 式 : C47H51NO14分 子 量 : 853.92物理性质 : 白色结晶体粉末。无臭，无味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。紫杉醇紫杉醇发现历史1963年美国化学家瓦尼（年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一）首次

6、从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和和 Wall发现紫杉醇粗提物对离发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克大学的化学教授姆克法年，他们才同杜克大学的化学教授姆克法尔（尔（Andre T. McPhail）合作，通过）合作，通过x-射线

7、分析确定了该活性成份的化射线分析确定了该活性成份的化学结构学结构一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。）。临床应用临床应用 临床研究上，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、临床研究上，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇是新型抗微管药物紫杉醇是新型抗微管药物,通过促进微管蛋白聚合抑制解聚通过促进微管蛋白聚合抑制解聚,保持微管保持微管蛋白稳定蛋白稳定,抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，抑制

8、细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗敏感的可能是使细胞中止于对放疗敏感的G2和和M期。期。 静脉给予紫杉醇静脉给予紫杉醇,药物血浆浓度呈双相曲线。本品蛋白结合率药物血浆浓度呈双相曲线。本品蛋白结合率89%98%,紫紫杉醇在肝脏代谢。紫杉醇主要在肝脏代谢，随胆汁进入肠道，经粪便排出体杉醇在肝脏代谢。紫杉醇主要在肝脏代谢，随胆汁进入肠道，经粪便排出体外（外（90%）。）。副作用副作用易引起过敏、骨髓抑制、心动过缓、低血压、易引起过敏、骨髓抑制、心动过缓、低血压、外围神经病、肌痛、关节痛、恶心、腹泻、黏膜炎和秃头症等外围神经病、肌痛、关节痛、恶心、腹泻、黏

9、膜炎和秃头症等：大多数抗癌药物低的溶解度、低稳定性和低吸收性，低生物利用度肠道或肝脏部位的细胞色素P450 酶对疏水性药物有代谢胃液环境下或酸性条件下P-糖蛋白（P-gp）过表达引起了肿瘤组织的多药耐药性亟待解决的问题1.稳定存在于胃液环境3.在载体表面键接特定抗体或配体实现主动靶向2.利用靶向治疗控制药物载体的纳的粒径在纳米级能够高通透和滞留（EPR）效应实现被动靶向实现组织、器官或细胞的靶向改善的方面提高口服抗癌药物的生物利用度的同时降低其毒副作用4.利用给药载体的pH 敏感壳聚糖（CS）聚电解质复合物（+-）壳聚糖纳米微粒具有附着在生物体粘膜表面的特性，且生物薄膜表面的类脂层的负电荷易发

10、生静电吸附增强了大分子药物透过粘膜吸收的能力，尤其适用于口服给药途径，延长了药物在体内的循环时间，有效地提高药物的生物利用度，减少副作用设计安全有效的壳聚糖给药体系，适用于多肽、蛋白质类的药物制剂壳聚糖及其衍生物能够以凝胶、颗粒、片剂、薄膜及微囊等的形态包封药物，应用于药物缓释和定向输送可降解性、低毒性、良好的生物相容性壳聚糖基聚电解质复合物纳米粒作为药物载体具有控制药物释放延长药物疗效、降低药物毒副作用及提高疏水性药物对细胞膜的通透性作用1、透明质酸一种天然多糖是细胞外基质的主要成份之一，具有低毒、生物相容性、可降解性及高度水合性等物理化学性能2.在一些恶性肿瘤或实体瘤边缘组织发现了大量透明

11、质酸受体CD44，它能够与透明质酸结合达到将其包吞的性能。3.透明质酸酶是广泛分布于肿瘤细胞外基质，在降解透明质酸的过程中扮演着重要角色。总结实体瘤中CD44 与透明质酸的这种关系，正好为化疗药物的靶向性输送提供了一种可能的途径，即通过透明质酸与CD44 受体结合介导的胞吞作用将药物靶向输送到肿瘤细胞内。透明质酸纳米粒纳米粒（1）直径小于500 nm，能在血液循环中经由毛细血管到达肿瘤部位（2）纳米材料载体可在体内降解（1）.聚合物包封药物进而形成如笼和胶囊的纳米结构纳米粒是指粒径为10-1000 nm 的固态胶体颗粒，聚合物纳米粒子已经被广泛地应用于纳米药物载体作为理想的纳米载药输送系统要有

12、以下特性三、载药纳米粒是通过以下两种方式形成（2）通过一个简单的酯键或酰胺键化学连接药物到聚合物骨架上禁食状态下胃部的pH 大约为胃胃肠饭后胃膜细胞会分泌出酸来消化所吸收的食物此时胃部的pH 约为小肠最上端的pH 约为，中部和尾部的空肠和回肠pH 约为7.4。PHpH 大约为肿瘤细胞外肿瘤细胞内正常组织细胞内涵体内pH 约为溶酶体内pH 约为pH 约为7.4。PH实验预期CS/HA-PTX CNPs是表面富集壳聚糖的带正电荷的聚电解质复合纳米 粒，而胃肠道组织中富含带负电荷的糖胺多糖，通过两者之间的正负电荷的相互 作用，明显增加聚电解质复合纳米粒在胃肠道壁中的吸收和驻留，使得聚电解质复合纳米粒

13、能够与胃肠粘膜上皮细胞充分接触，被上皮细胞粘附并吸收，通过 壳聚糖打开肠壁粘膜上皮细胞间结点，进而使得HA-PTX NPs进入血液循环，然 后通过透明质酸介导的主动靶向作用和EPR效应成功地积聚在肿瘤组织。以pH敏感的 壳聚糖/透明质酸-药物的给药系统，相比于游离的药物溶液直接口服，能够达到 保证药物在胃肠道长时间滞留，维持药物在肿瘤部位的缓慢、持久释放，进而达 到提高肿瘤部位的药物浓度，而且降低其对正常细胞的细胞毒性实验方面实验方面 合成 检测细胞毒性体内组织分布实验释放度PH影响胞吞实验娄莹等.CYP2C9和VKORCI基因多态性对肺栓塞患者华法林维持剂量的影响J.中国药物警戒，2012，

14、9（4）HA-PTX 较透明质酸的主要区别在于 891、1378 及 2893 cm-1 处的吸收增强，1618 cm-1 处 C=O 双键吸收峰变成尖锐的 强峰，证明了透明质酸中的羧基发生了反应且有新的甲基吸收出现，出现共轭 C=O 吸收峰，由此可以初步判定紫杉醇连接到了聚合物上化学位移在 7-8 ppm 的新峰代表了紫杉醇的特征峰，从而证明了我们利用化学共价键接成功合成了 HA-PTX。与紫杉醇对比，HA-PTX 键合物在 D2O 中紫杉醇在 7-8 之间的峰不明显，而在它的良溶剂 DMSO-d6 中， 7-8 之间的峰明显出现，这说明形成的 HA-PTX 为核壳结构。HA-PTX 键合物

15、中键合物中 PTX 的含量的含量 通过配置不同浓度的紫杉醇的乙腈溶液，用 HPLC 测试其出峰面积，以浓度 对峰面积作图，得到紫杉醇的峰面积-浓度标准曲线紫杉醇的峰面积与其浓度呈线性关系，经拟合得： Y=7.4871110-5X，其中 Y 为紫杉醇浓度，X 为峰面积。根据此线性关系，测定 已知浓度 HA-PTX 键合物的出峰面积，可以计算出其中紫杉醇的浓度，进而根 据公式 3-1 计算出 HA-PTX 中紫杉醇的含量为 10.6 wt%随着 pH 值的增加，HA-PTX NPs 的电 位呈现下降的趋势，由 5 mV 降低到-31 mV；当 pH 值为 2.1 时，纳米粒的 Zeta 电位接近于

16、 0，说明纳米粒的 pKa 为 2.1.HA-PTX NPs的电位图 3-7 A 为 HA-PTX 的电镜照片，由材料的冻干粉再分散，制备浓度为 1 mg/mL 的材料，用透射电镜观察其形貌，平均粒径 约为 50 nm 左右，呈球形，粒径分布较均匀，分散性好。透明质酸与紫杉醇通过共价键结合，自发地聚集形成壳-核的结构，紫杉醇被保护在胶束的内核中，胶 束外层由亲水性的透明质酸构成。如图 3-7 B 所示，由激光粒度仪测定的纳米粒 的粒径约为 80 nm 左右比之从 TEM 中观察的要高，这是由于在用透射电镜观测 粒径时纳米粒是处于一个干态的，而在用激光粒度仪测定粒径时，纳米粒的亲水 性部分能够在

17、溶液中以一个伸展形式存在。图 3-8 为通过荧光光谱法对一系列浓度的 HA-PTX 键合物水分散液进行芘 激发光谱扫描后，以 I338/I333 对不同 HA-PTX 键合物浓度的对数 logC 做的两条 直线，如图所示，当键合物浓度较低时，呈现一条接近于水平的直线，当键合物 浓度增大到一定程度时， I338/I333突然增大，这表明芘从亲水环境中被包进了疏水 区域，此时胶束开始形成。两条曲线的交点即是 HA-PTX 键合物的临界胶束浓 度，大约是 110-3 mg/mL。小结一在 DCC 和 DMAP 的催化作用下，通过酯化反应制备了 HA-PTX 键合物，FT-IR 及 1H-NMR 结果

18、表明，目标产物被成功合成且可自组装成核-壳 型结构。HPLC 结果表明 HA-PTX 中紫杉醇的含量为 10.6 wt %。粒径及电位结 果表明 HA-PTX 能在水中形成纳米粒且 pKa 值为 2.1，TEM 说明 HA-PTX 在水 中能自组装成粒径约为 80 nm 左右的纳米粒，临界胶束浓度为 110-3 mg/mLHA-PTX CNPs除了正负 电荷比（CS中的正电NH3+与HA-PTX中的负电-COO-）为1:1时，无法形成聚电解 质复合纳米粒，在其他电荷比如3:2、2:1、3:1和4:1时均能形成粒径约为160-350 nm的CS/HA-PTX CNPs。当正电荷的CS的量远远超过

19、了带负电荷的HA-PTX 时，过量的CS分子覆盖在CS/HA-PTX CNPs表面，形成高溶解性的聚电解质复 合纳米粒。综合各电荷比下的粒径及载药量，电荷比为2:1时聚电解质复合纳米 粒具有较小粒径与较高载药量，进而取其为最佳合成条件CS/HA-PTX CNPs图 4-2 A 中，在 2106 cm-1 和 1412 cm-1 处出现了吸收峰， 该峰的出现可能是由于为壳聚糖上的-NH3+与 HA-PTX 纳米粒冻干粉上的-COO发生了静电复合作用。 4CS/HA-PTX CNPs其中当pH 值为5.0时，聚电解质复合纳米粒的粒径最小，这就说明此由聚阳离子与聚阴离 子合成的聚电解质复合纳米粒在p

20、H 5.0时稳定性最好。当pH值为1.2或7.4时，聚 电解质复合纳米粒崩解，这是由于在pH 1.2下聚阴离子HA-PTX产生了去质子化 作用而聚阳离子壳聚糖在pH 7.4时发生去质子化作用。CS/HA-PTX CNPs壳聚糖和HA-PTX 的pKa值分别为6.5和2.1。在pH 1.2（即饭后胃部pH）下，HA-PTX中的大部分羧 基去质子化形成-COOH，CS与HA-PTX的静电作用较弱，在此pH下形成的聚电 解质复合纳米粒很不稳定，容易解体，如图4-3 A所示。而pH 3.0时，CS/HA-PTX 形成粒径在200 nm左右的聚电解质复合纳米粒，因此，CS/HA-PTX CNPs只能在

21、饭前服用（饭前胃部）CS/HA-PTX CNPs对比不同 pH 条 件下的三条曲线可知，HA-PTX NPs 具有 pH 敏感性。在酸性环境下 pH=3.0， pH=5.0，纳米粒的药物释放速率要明显高于在 pH=7.4 的释放速率。这种现象主 要是由于在低 pH 值下，有利于聚合物材料的降解。HA 与紫杉醇通过酯键连接， 酸性条件可以促进酯键的水解，从而有利于药物的释放。因此，紫杉醇从 HA-PTX NPs 中的释放在酸性条件下释放速率要比中性条件快。 CS/HA-PTX CNPsHA-PTX NPs 在 pH 3.0（禁食胃液环境）下两小时紫杉醇的累计释放 率大概为 19 %，CS/HA-

22、PTX CNPs 的释放在 pH 3.0 下两小时紫杉醇的累计释放 率大概为 8 %，由此可以看出，聚电解质纳米粒外壳富余的壳聚糖可以保护 PTX 在酸性条件不从 HA-PTX NPs 中释放出来。CS/HA-PTX CNPs图 4-7 主要是模拟饭前口服给药的吸收，饭前服用药物制剂其在胃里的存留 时间大概在两小时左右，由图 4-7 可知，在禁食胃液环境中，CS/HA-PTX CNPs 中紫杉醇的累计释放率大概在 11 %左右，能够很好的保持紫杉醇的稳定性进而 到达小肠部位。而当其进入小肠部位时，肠液的 pH 值在 6.0-7.0 间，在此时间段 内 CS/HA-PTX CNPs 中紫杉醇的累

23、计释放率达到 35 %左右根据此线性 关系，测定已知浓度 RB-HA-PTX NPs 溶液的吸光度，可以计算出其中罗丹明 B 的浓度，计算出 RB-HA-PTX NPs 中罗丹明 B 的含量为 5.1 %罗丹明在细胞核和细胞质内均有 分布，并且荧光强度很强，然而进入正常细胞的纳米粒相对来说非常少。这主要 是由于癌细胞表现活跃，RB-HA-PTX NPs能够通过胞吞作用进入癌细胞而只能 通过扩散作用进入正常细胞。胞吞图 B 与 D 比 较可知，加有游离透明质酸的 RB-HA-PTX NPs 被细胞胞吞的量相对于 RB-HA-PTX NPs 来说明显降低，说明 B 中增加的游离透明质酸与 RB-H

24、A-PTX NPs 溶液产生了竞争，也就表明透明质酸介导纳米粒内吞入胞的有效性。综上所 述，RB-HA-PTX NPs 进入细胞是通过透明质酸受体介导的并且可以保护 PTX 不 被泵出细胞膜。当空白材料浓度为100 g/mL时，HepG2细胞和NIH-3T3细胞的细胞存活率分别为 93 %和79 %，这充分说明空白材料HA对于HepG2细胞和NIH-3T3细胞来说均具 有良好的生物相容性。图4-13B为紫杉醇制剂及HA-PTX NPs对HepG2细胞的细胞 存活状况，结果表明，紫杉醇制剂及HA-PTX NPs对于HepG2细胞具有一定的细 胞毒性，并呈现良好的剂量依赖性荧光成像图4-15为用RB荧光标记的 口服CS/HA-PTX CNPs和紫杉醇溶液12 h后，各组织药物的分布情况。口服游离 药物后，药物主要分布在肝脏，肾脏、胃部和小肠，在肿瘤部位的分布很少，这 说明直接口服药物会很快被肝脏及肾脏代谢掉，进入肿瘤部位进而发挥药效的药物很少小结二（1）CS/HA-PTX CNPs 在正负电荷比为 2:1 时测得的粒径约为 120