[emuch]第23章___分子质谱法

1、 质谱法是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比(MZ)大小进行分离并记录其信息的分析方法。所得结果以图谱表达，即所谓的质谱图（亦称质谱，Mass Spectrum）。根据质谱图提供的信息可以进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等。 从20世纪60年代开始，质谱法更加普遍地应用到有机化学和生物化学领域。化学家们认识到由于质谱法的独特的电离过程及分离方式，从中获得的信息是具有化学本性，直接与其结构相关的，可以用它来阐明各种物质的分子结构。正是由于这些因素，质谱仪成为多数研究室及分析实验室的标准仪器之一。 分子质谱和原子

2、质谱的原理和仪器总体结构基本相同，但因研究对象不同，其仪器各部分结构、技术和应用与原子质谱有很大差别。1. 获得的信息量大 2. 进样方式多样化 3. 多种离子化技术 4. 质量范围不同 5. 发展历程差异 质谱不是光谱，是物质的质量谱。质谱中没有波长和透光率，而是离子流或离子束的运动，有类似于光学中的聚焦和色散等离子光学概念。 分子电离后形成的离子经电场加速从离子源引出，加速电场中获得的电离势能z e U转化成动能Kinetic Energy，KE，SI单位为焦尔(J)1/2 m2，两者相等，即 具有速度的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，就存在沿着原来射出方向直线运动的离心力(m2/R)和

3、磁场偏转的向心力(Bze)作用，两合力使离子呈弧形运动，二者达到平衡： 整理后得：离子在磁场作用下运动轨道半径为：UzmBR144UBKzm2/ 分子质谱仪器仪器由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、真空系统及电子、计算机控制和数据处理系统等组成。 进样系统的目的是在不破坏真空环境、具有可靠重复性的条件下，将样品引入离子源。23.3.2.1. 加热进样加热进样23.3.2.2. 直接进样直接进样23.3.2.3.色谱进样色谱进样 质谱仪通常会与气相色谱、液相色谱等仪器联用，用于分离和检测复杂化合物的各种组分。将色谱分离后的流出组分通过适当的接口引入质谱系统，称之为色谱进样。23.3.2.4.

4、 标准进样标准进样 有机质谱一般以全氟煤油(Perfluorokerosene，PFK)为仪器质量标准样品。PFK从69至1200分子相对质量以上，几乎每隔12个质量有一个特征峰，主要特征峰的精确质量均已测定。由于PFK的记亿效应较强，如用加热进样或直接进样系统进样，容易造成污染。因此，不少仪器装有专用PFK标准样进样系统。 按照样品的离子化过程，离子源（Ion Sources）主要可分为气相离子源和解析离子源。 按照离子源能量的强弱，离子源可分为硬离子源和软离子源。 分子质谱仪器的离子源种类繁多，现将主要的离子源逐一介绍。 电子轰击源(Electron-Impact Soures ，EI)应

5、用最为广泛，主要用于挥发性样品的电离。 电子轰击源电离效率高，能量分散小，结构简单，操作方便，工作稳定可靠，产生高的离子流，因此灵敏度高。 化学电离源(Chemical Ionization Sources, CI )和电子轰击电离源主要差别在于CI源工作过程中要引进一种反应气体。 场电离源(Field ionization Sources, FI)是应用强电场诱导样品电离的一种离子化方式。 场电离源分子需气化后电离，不适用于难挥发、热不稳定的有机化合物。因而发展出场解吸电离源(Field desorption Ionization Sources, FD)，使用了和场电离源相似的多针尖发射场

6、。 样品无需气化再电离，特别适于非挥发性、热不稳定的生物样品或相对分子质量高达100,000的高分子物质。样品的电离行为较为简单，所获得的质谱信号也大大简化，常常只看到分子离子峰或是质子化的准分子离子峰。 快原子轰击源（Fast Atomic bombardment Sources, FAB）主要用于极性强、高分子量的样品分析。 激光解吸电离源（Laser Desorption Ionization Sources，LD）是一种结构简单、灵敏度高的新电离源。它利用一定波长的脉冲式激光照射样品使样品电离，被分析的样品置于涂有基质的样品靶上,脉冲激光束经平面镜和透镜系统后照射到样品靶上,基质和样品

7、分子吸收激光能量而气化，激光先将基质分子电离，然后在气相中基质将质子转移到样品分子上使样品分子电离。激光电离源需要有合适的基质才能得到较好的离子产率。因此，这种电离源通常称为基质辅助激光解吸电离(Matrix-Assisted Laser Description /Ionization, 简称MALDI)。 基质必须满足下列要求：能强烈的吸收激光的辐照，能较好的溶解样品并形成溶液。 MALDI特别适合于飞行时间质量分析器 (TOF),组成MALDI-TOF质谱仪。MALDI属于软电离技术，它比较适用于分析生物大分子，如肽、蛋白质、核酸等,对一些相对分子质量处于几千到几十万之间的极性的生物聚合物

8、，可以得到精确的分子量信息。 质量分析器(Mass analyzer) 的作用是将离子源产生的离子按质荷比（m/z）顺序分离。23.3.4.1.磁分析器磁分析器1.扇形磁场和扇形电场的离子光学性质 扇形磁场的基本性质是：质量色散能力、能量色散能力、方向聚焦能力。2.双聚焦型磁分析器 磁分析器可分为单聚焦分析器（Single-focusing analyzer）和双聚焦分析器（double-focusing analyzer），前者为单一扇形磁场;后者由电场、磁场串联而成。 飞行时间质量分析器(Time of flight mass analyzer，TOF)的主要部分是一个长1m左右的无场离子

9、漂移管。 离子阱质量分析器（Ion Trap Analyzer）是一种通过电场或磁场将气相离子控制并储存一段时间的装置。 分子质谱仪器采用的检测器等与原子质谱类似，早期质谱离子直接打在插入磁场的感光板上，称质谱仪(Mass Spectrograph); 后来接收离子进行电学放大，主要包括Faraday杯、电子倍增器，光电倍增管等，用笔记录器记录，称质谱计(Mass Spectrometer)。现代质谱仪器均采用紫外线示波感光记录器记录质谱峰，计算机采集、处理质谱数据给出归一化捧图和表。1.数据采集和简化 2.质量数转换和峰强度归一化 3. 谱图累加、平均 4.用总离子流对峰强度进行修正 5.

10、输出质量色谱 6.给出高分辩率质谱的元素组成。7.谱图检索 分子质谱分析过程中在离子源或无场区等发生下列4类离子化及其反应：1.分子离子化反应;2.裂解反应;3.重排、裂解反应;4.离子-分子反应。 样品分子失去1-2个电子(多数为1个电子)而得到的离子称为分子离子 (Molecular Ion)。 许多元素都是由具有一定自然丰度的一或多个同位素组成，这些元素形成化合物后,其同位素就以一定的丰度出现在化合物中。因此，当化合物被电离时，由于同位素质量不同，在质谱图中离子峰会成组出现，每组峰会显示出一个强的主峰; 亦发现有一些峰的m/z大于样品的分子量。 分子离子产生后可能具有较高的能量，将会通过

11、进一步裂解或重排而释放能量，裂解后产生的离子称为碎片离子(Fragment Ion)。 在两个或两个以上键的断裂过程中，某些原子或基团从一个位置转移到另一个位置所生成的离子即重排离子(Rearrangement Ion)。 若质量为m1的离子在离开离子源受电场加速后，在进入质量分析器之前，由于碰撞等原因很容易进一步分裂失去中性碎片而形成质量m2的离子。23.5.1.磁扫描技术磁扫描技术 由于应用目的不同，扫描方式可分为指数扫描、线性扫描、单次和循环扫描。23.5.2.加速电压选择加速电压选择 离子m/z与加速电压U呈反比，U越高，测定离子质量范围越小，而降低U可扩大质量范围。但实际操作中，并不

12、以无限制降低加速电压，以期获得更高质量范围，而是以尽可能选择高U，以求获得尽可能高的分辨率和灵敏度。只有在分子量较大时，才适当降低U，以稍扩大质量范围。23.5.3.影响分辨率和灵敏度操作条件影响分辨率和灵敏度操作条件 1.分析器入口主缝(S1)和分析器出口接收缝(S2)的大小；2.离子源推斥、引出、聚焦等电极电位及与静电场电压匹配性；3.噪声信号；4.分析系统真空度；5.要尽量防止离子源、分析器污染；6.扫描速度适当；7.分辨率选择。23.5.4.进样技术进样技术 比较纯的样品或熔点相差较大多组分混合物，采用程序升温直接进样，不同熔点化合物会先后气化。不同时间扫描可获得不同组分质谱。复杂混合

13、物根椐沸点、热稳定性需气相或液相色谱进样。 不论采用何种进样，在获得预期分析目标前提下，尽量降低进样量。过量样品会导至灵敏度降低、有损电子倍增器寿命、甚至超出计算机数据系统峰强范围而无法归一化。23.6.1.化合物的定性分析化合物的定性分析23.6.1.1.标准谱图检索定性标准谱图检索定性 将在一定质谱分析条件下获得的质谱图与相同条件下标准谱图对照是对已知纯化合最简便定性方法。23.6.1.2.相对分子质量测定相对分子质量测定 分子离子峰的m/z可提供准确分子相对质量，是分子鉴定的重要依据。获得分子离子、准确地确认分子离子峰是质谱定性分析的主要方法之一。 在质谱图中，可根据如下特点确认分子离子

14、峰在质谱图中，可根据如下特点确认分子离子峰: 1. 原则上除同位素峰外，分子离子或准分子离子是谱图中最高质量峰，两者均可推导出分子量。 2. 它要符合氮律。 3.判断最高质量峰与失去中性碎片形成碎片离子峰是否合理。 4.当化合物含有氯和溴元素，有时可帮助识别分子离子峰。 23.6.2.1. 分子式确定分子式确定 1.由同位素相对丰度法推导分子式 2. 用高分辨质谱仪器确定分子式 高分辨质谱仪器测定分子离子或碎片离子质荷比的误差可小于10-5，可求出分子离子峰的精密质量。因此，用高分辨质谱仪器测定精确相对分子质量与Beynon表的数据对照，配合其他信息即可确定合理的分子式。23.6.3.1. 质

15、谱直接定量分析质谱直接定量分析质谱直接定量分析有几个基本假设或条件: 1.组分特征峰及强度不受样品中其他组分或本底干扰。 2.样品中任何组分的离子流强度与其在进样装置中的分压呈正比。 3.样品中存在具有相同特征谱峰的组分，发生质谱峰叠加时，叠加峰的强度是各被叠加峰强度的线性累加。 单一组分定量：单一组分定量： 可在质谱上确定合适的m/z值，其峰高与组分浓度呈正比，这个技术称为选择离子检测。混合的样品多组分定量：混合的样品多组分定量： 各组分特征峰无叠加，可以代表各个组分具有特定m/z值的质谱特征峰强度作为定量依据。若组分特征峰发生叠加，则需通过叠加特征峰强度的线性累加方程计算各组分含量。 23

16、.6.3.1. 质谱直接定量分析质谱直接定量分析 无论单一组分或多组分定量均可采用内标法，选择待测物与内标物特征或碎片离子作为定量依据，待测物相对内标的峰信号强度之比是被分析物浓度的函数。加入内标是为了减少样品制备和引入过程中的误差。一种方便的内标就是用同位素标记被分析物的相似物。 另一种内标是分析物的同系物，它可以得到和被分析物碎片相似碎片峰，并且具有相当的强度，可以被检测到。23.6.3.2. 复杂混合物定量复杂混合物定量 对于含10个以上，数十乃至数百个组分的复杂混合物，求解联立方程过于复杂，难以质谱直接定量，通常采用色谱-质谱联用分析，让样品先通过各种色谱柱分离，再将流出物引入质谱检测

17、。 单克隆抗体基质辅助激光解吸电离质谱图 人血清蛋白的基质辅助激光解吸电离质谱图 质谱直接分析样品要求是纯或比较纯的，如为简单混合物，则各组分应具有基本互不干扰的特征质谱峰。对于成分复杂混合物，由于杂质峰、碎片峰等重叠、干扰，谱图过于复杂，难以进行多组分的分析、鉴定。 色谱是目前分离复杂混合物最有效的方法，然而由于色谱自身不具备定性能力或定性可靠性欠佳。将色谱分离能力与质谱定性、结构鉴定能力结合起来，可实现复杂混合物的分析。 目前，质谱与其他技术的联用已经非常广泛，如气相色谱质谱联用（GC-MS）、液相色谱质谱联用（LC-MS）、质谱质谱联用（又称串连质谱, MS-MS）、傅立叶变换红外质谱联

18、用（FTIR-MS）、毛细管电泳质谱联用(CE-MS)等。 23.7.2.1. GC-MS接口接口 理想的接口应当能够除去全部载气，然而却不损失待测样品组分。1.直接导入型接口23.7.2.1. GC-MS接口接口2.开口分流型接口（Open-Split Coupling）1.限流毛细管，2.外套管，3.中隔板，4.内套管23.7.2.1. GC-MS接口接口3.喷射式分子分离器接口 色谱分离柱的选择，必须采用充分老化或限制使用温度的方法，尽量避免色谱柱的固定液流失以降低质谱仪器检测噪声。必须根据接口部件的特点选择不同类型的色谱柱。 对载气亦有一定的要求，载气必须纯度高、化学稳定性好、易于和待

19、测组分分离、易于被真空泵排出。通常在GC-MS中选用的载气为氦气，纯度在99.995%以上。 质谱仪器的真空系统必须具备很高的效率、大的排空容量，以利于将载气最大限度的抽出质谱仪器，避免载气对待测样品的电离、分析等干扰。 另外，质谱仪必须具备高的扫描频率：气相色谱分离高效、快速，色谱峰都非常窄，有的仅几秒钟时间。一个完整的色谱峰通常需要6个以上的数据采集点，质谱仪必须具备较高的扫描速度，才可能在很短的时间内完成多次全质量范围的扫描。 为了使每个组分都实现良好的分离与鉴定，必须设定合适的色谱和质谱分析条件。 色谱条件包括色谱柱的类型（填充柱或毛细管柱）、固定液种类、载气种类、载气流量、样品汽化温

20、度、分流比、程序升温方式等。设置的一般原则是：优先选用毛细管气相柱、极性样品使用极性柱、非极性样品采用非极性柱、未知样品可先尝试中等极性的色谱柱，尔后根据实际情况做适当调整。 质谱工作条件包括电离电压、扫描速度、扫描质量范围、扫描模式等等，这些均要根据实际样品情况、实际测试需求进行设定。 GC-MS数据的采集与质谱仪器对数据的采集相同，如分离分析含50个组分的样品，则每个样品需采集105以上质谱数据，采集和处理数据量比一般分析单一成分纯样品大得多。 1. 总离子流色谱图2. 质谱图 由总离子流色谱图可以得到任何一组分的质谱图，离子流进入质量分析器，只要设定好分析器扫描的质量范围和扫描时间，计算

21、机就可以采集到每个组分洗出过程中连续的质谱信号。如果色谱分离良好，根据扫描速度，每个色谱峰可采集到多组分全扫描质谱图，且同一组分不同色谱峰位置的质谱图应基本一致，但强度不同。 3.质量色谱图 总离子流色谱图是将单位时间内所有离子加合得到的。也可以通过选择不同质量的离子做质量色谱图(MC)，使色谱不能分开的两个峰实现分离，以便进行定性、定量分析。 4. 库检索 GC-MS灵敏度是指在一定的样品、一定的分辨率下，产生特定信噪比的分子离子峰所需的样品量。 1、GC-MS检测猪肉中的克伦特罗检测猪肉中的克伦特罗501001502002503003504004500.025.050.075.0100.0

22、%867326257243212187132166116333280391415313448经BSTFA衍生的克伦特罗质谱图 1、GC-MS检测猪肉中的克伦特罗检测猪肉中的克伦特罗添加20g/kg克伦特罗猪肉样品的选择离子（m/z86）色谱图 2、GC-MS检测唾液中的四氢大麻酚检测唾液中的四氢大麻酚25.050.075.0100.0125.0150.0175.0200.0225.0250.0275.0300.0325.00.025.050.075.0100.0%2993142312712432171939117411543772851476532四氢大麻酚的质谱图 唾液样品GC-MS测定四氢

23、大麻酚的选择离子色谱图（m/z 299, 271, 231, 243） HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。与GC-MS相比，LC-MS连接更为复杂，对接口的要求更为苛刻。LC-MS是在研究出热喷雾电离（TSI）、大气压化学电离（APCI）后才获得迅速的发展。当前在LC-MS中，许多接口技术已基本融入质谱的离子源系统中。 23.8.1.1.接口的要求和发展接口的要求和发展 接口装置是LC-MS联用的技术关键之一，其主要作用是去除溶剂并使样品离子化。 1980s年代，大气压电离源用作LC和MS联用的接口和电离装置之后，使得LC-MS联用技术提高了一大步。目前，几乎所有的LC-MS联用仪都使用

24、大气压电离源作为接口装置和离子源。23.8.1.2.直接液体导入接口直接液体导入接口 直接液体导入接口（DLI）实际上是将LC的柱后流出物经分流后，很少一部分在质谱仪真空泵抽引产生的负压驱动下，通过金属毛细管或多孔薄膜喷射形成细小的液滴，进入接口，在加热条件下脱去溶剂，然后样品再进入离子源实现离子化。 23.8.1.3. 移动带接口移动带接口 移动带接口（Moving belt, MB）是最早研究的LC-MS接口之一。其接口原理是在LC柱后增加一个移动速度可调整的传送带，传送带置于红外线加热场中。 23.8.1.4. 热喷雾接口热喷雾接口 热喷雾接口（thermospray, TS）出现于19

25、80s年代中期，是第一个被广泛使用的LC-MS商用接口，它将接口和电离技术有机的融为一体。热喷雾接口的核心部件是能够加热的不锈钢毛细管。 当LC的流出物以12ml/min的流速进入TS中心的不锈钢毛细管（约0.1 mm内径、1.6mm外径），在毛细管出口前受到剧烈加热，溶剂快速蒸发，体积膨胀，以超声音速喷出毛细管，形成由微小液滴、粒子和蒸气组成的雾状混合体。 当混合体向下游移动时，部分在热喷射过程中已带电荷的小液滴溶剂继续蒸发，表面积迅速缩小，当电荷与液滴表面积之比达到一个临界值时，溶质以离子或离子聚合体的形式从液滴蒸发出来，进入气态，实现质谱分析所需的样品电离，这就是“离子蒸发理论”。 23

26、.8.1.5. 粒子束接口粒子束接口 粒子束接口（Particle beam, PB）又称为动量分离器，接口是利用流体力学原理，将溶质转变成中性粒子，利用动量差与溶剂分开后，送入质谱的电离系统。 23.8.1.6.大气压电离接口大气压电离接口 大气压电离（atmospheric pressure ionization, API）接口的设计跳出传统思维：利用待测样品与溶剂电离能力的不同，将分析物首先在大气压或略低于大气压条件下电离，尔后利用电场导引，将带电样品“萃取”进入质谱高真空系统。 与传统的方法相比，大气压电离接口模式利用待测样品和溶剂间带电能力的差异，更利于将二者分开。同时，大气压电离接

27、口更容易和LC相匹配。 1.电喷雾电离电喷雾电离 (Electron spray Ionization，ESI) 既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置，同时又是电离装置。 包括三个基本过程：电喷雾、离子的形成、离子的输送。 电喷雾电离源是一种软电离方式。 2.大气压化学电离源大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI) 主要用来分析中等极性或非极性的化合物。有些样品由于结构和极性方面的原因，用电喷雾电离方式无法产生足够强的离子信号时，可以采用APCI方式增加离子产率。 1、辅助气；2、样品入口；3、喷雾气；4，5、加热器；6，

28、7，8、气帘；9，10、低温外壳；11、锐孔; 12. 针状放电电极。 在LC-MS的联用中，LC必须与MS相匹配，首先就是色谱流动相液流的匹配，包括液流的流速、稳定性等。 另外，LC必须提供高精度的输液泵，以保证在低流速下输液的稳定性。对于分析柱，则最好选用细内径的分离柱，与低流量LC相匹配，从根本上减轻LC-MS接口去除溶剂的负担。 在LC-MS联用中，质谱仪器的真空系统必须具备很高的效率、大的排空容量，以利于将溶剂气最大限度的抽出质谱仪，避免引入质量分析系统，对待测样品的分析造成干扰。 质谱仪器应当具有较宽的质量测定范围，利于大分子、蛋白质等生物样品的分析。质谱仪器应当匹配多种接口，利于

29、互换以适应不同的待测样品分析需求。 23.8.4.1. LC分析条件的选择分析条件的选择 LC分析条件的选择要考虑两个因素：使分析样品获得最佳分离并有利于其电离。如果二者发生矛盾，则需折中考虑。23.8.4.2. 质谱条件的选择质谱条件的选择 质谱条件的选择主要是为了改善雾化和电离状况，提高检测的灵敏度。调节雾化气流量和干燥气流量可以达到最佳雾化条件，改变喷咀电离电压和聚焦透镜电压等可以得到最佳灵敏度。对于多级质谱仪器，还要调节碰撞气流量和碰撞电压及多级质谱的扫描条件。 对于不同的样品应当根据样品的荷电能力的不同、荷电性质的差异，选择不同的质谱电离方式和工作模式。 23.8.4.3. LC-M

30、S定性、定量分析定性、定量分析 LC-MS分析得到的质谱过于简单，结构信息少，进行定性分析比较困难，主要依靠标准样品定性。 当缺乏标准样品时，为了对了样品定性或获得其结构信息，必须使用串联质谱检测器，将准分子离子通过碰撞活化得到其子离子谱，然后解释子离子谱来推断结构。 用LC-MS进行定量分析，其基本方法与普通液相色谱法相同。对于LC-MS定量分析，不采用总离子色谱图，而是采用与待测组分相对应的特征离子得到的质量色谱图或多离子监测色谱图，此时，不相关的组分将不出峰，这样可以减少组份间的互相干扰。 23.8.4.3. LC-MS定性、定量分析定性、定量分析 与GC-MS相同，LC-MS的灵敏度是指在一定的样品、一定的分辨率下，产生特定信噪比的分子离子峰所需的样品量。LC-MS常采用利血平作为标准样品来测定其灵敏度。 例如: 配置一定浓度的利血平（如10pg/l），通过LC进适当量样品，以水和甲醇各50%为流动相（加入1%乙酸），做质量范围全扫描，提取利血平分子离子峰m/z 609的质量色谱图，计算其信噪比，最终仪器的灵敏度用进样量和信噪比标定。 LC-MS联用（Waters ZQ）测定蜂蜜中的氯霉素残留 CE与质谱联用