最新微生物限度检查方法验证方案

1、精选文档微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1 .供试液的制备1.1. 取供试品10g ，加 pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml ，充分振摇使混匀，作为1:10 的供试液。1.2. 取 1:10 供试品 10ml ，加 pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml ，充分振摇使混匀，作为1:100 的供试液。1.3. 取 1:100 供试品 10ml ， 加 pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml ， 充分振摇使混匀，作为1:1000 的供试液。备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45 。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。2 . 菌液制备

2、2.1. 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆陈液体培养基中，30? 35 c培养1824小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、制成每1ml 含菌数为小于100cfu 的菌悬液。2.2. 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20? 25 C培养23天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每 1ml含菌数为小于100cfu 的菌悬液。2.3. 将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20? 25 培养5

3、? 7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml 含 0.05% （ ml/ml ）聚山梨酯80 的 0.9%无菌氯化钠溶液或 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ ml/ml ） 聚山梨酯80 的 0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。2.4. 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2 小时之内使用；若保存在28 ，可在 24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28 ，在验证过的贮存有效期内使用。3 .计数方法的验证3.1. 需氧菌、霉菌及酵

4、母菌计数（平皿法）所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。3.1.1. 试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml 供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu 。取的供试液9.9ml 和小于 10000cfu 的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml 混匀后，吸取1ml 注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固，于3035 c倒置培养3天点计菌落数。平行制备2 个平皿。取的供试液9.9ml 和小于 10000cfu 的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml 混匀后，吸取1

5、ml 注入平皿中，立即倾注胰酉&大豆陈琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固，于3035 c倒置培养3 天点计菌落数。平行制备2 个平皿。取的供试液9.9ml 和小于 10000cfu 的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml 混匀后，吸取1ml 注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固，于3035 c倒置培养3天点计菌落数。平行制备2 个平皿。取的供试液9.9ml 和小于 10000cfu 的白色念珠菌菌悬液0.1ml 混匀后，吸取1ml 注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固，于3035c倒置培养3天点计菌落数。平行制备2 个平皿。取的供试

6、液9.9ml 和小于 10000cfu 的黑曲霉菌悬液0.1ml 混匀后， 吸取 1ml 注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固，于3035c倒置培养3大点计菌落数。平行制备2 个平皿。取的供试液9.9ml 和小于 10000cfu 的白色念珠菌菌悬液0.1ml 混匀后，吸取1ml 注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固，于2025c倒置培养5天点计菌落数。平行制备2 个平皿。取的供试液9.9ml 和小于 10000cfu 的黑曲霉菌悬液0.1ml 混匀后， 吸取 1ml 注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml ,混匀，凝固

7、，于2025c倒置培养5大点计菌落数。平行制备2 个平皿。3.1.2. 菌液组取小于100cfu 的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基约 15 20ml ,混匀，凝固，于3035 c倒置培养3大点计菌落数。各平行制备2个平皿。取小于100cfu 的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml ，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各1520ml ,混匀，凝固，于2025 c倒置培养5大点计菌落数。各平行制备2个平皿。3.1.3. 供试品对照组一取的供试液1ml,注入平皿中，分别立即倾注1520 ml温

8、度不超过45 c胰酪大豆陈琼脂 培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆陈琼脂培养基3035 c倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基 2025 c倒置培养5大点计菌落数。各组平行制备 2 个平皿。3.1.4. 结果判断可编辑精选文档3.1.4.1 计算公式：稀释剂对照组菌数的回收率 =（稀释剂对照组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数试验组菌数的回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数3.1.4.2 判定标准：实验组、稀释剂对照组（如有）的菌数回收率应在 0.52之间。若各试验菌的回收 率均符合 规定，照所用的供试液

9、制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。3.1.5. 验结果供试品批号、。菌种类型试验次数菌液组实验组供试品对照组回收率铜绿假单胞菌1平均2平均3平均金黄色葡锢球菌1平均2平均3平均枯草芽抱杆菌1平均2平均3平均白色念珠菌（需氧菌验证）1平均2平均3平均黑曲霉（需氧菌验证）1平均2平均3平均白色念珠菌（霉菌、酵母菌1验证）平均2平均3平均黑曲霉（霉菌、醉母菌验证）1平均2平均3平均结果判定:验证人：复核人：日期：日期：4 .控制菌检查4.1. （大肠埃希菌）的验证4.1.1. 试验组取的供试液ml （取相当于1g或1ml供试品的供试液），小于100cfu的大肠埃希菌菌

10、悬液1ml ,加至约100ml的胰酪大豆豚液体培养基，于 3035c培养1824小时。4.1.2. 阴性对照组取pH7.0无菌氯化钠蛋白冻缓冲液10ml ,加至约100ml的胰酪大豆豚液体培养基，于3035 c培养1824小时。4.1.3. 阳性对照组取小于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml ,加至约100ml的胰酪大豆豚液体培养基，于 3035 c培养1824小时。4.1.4. 检查取上述培养物1ml ,接种至含100ml麦康凯液体培养基内培养，4244 c培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上3035 C培养1872小时。检查结果如下：第一次试验结果：供试品批号：

11、厅P步骤实验组阳性对照组阴性对照组1胰酪大豆陈液体培养基，30 35 C培养18 24小时2麦康凯液体培养基，42 44 c培养24 48小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035c培养1872小时若麦康凯琼脂培养基平板上后菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验 ，确证是否为大 肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没启菌落生长， 或虽由菌落生长但鉴定结果为阴性， 判 未检出大肠埃希菌。4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：第二次试验结果: 供试品批号:厅P步骤实验组阳性对照组阴性对照组1胰酪大豆陈液体培养基，30 35 C培养18 24小时2麦康凯液体培养基，42 44 c

12、培养24 48小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035c培养1872小时若麦康凯琼脂培养基平板上后菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验 ,确证是否为大 肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没启菌落生长， 或虽由菌落生长但鉴定结果为阴性， 判 未检出大肠埃希菌。4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：第三次试验结果: 供试品批号:厅P步骤实验组阳性阴性对照组对照组1胰酪大豆陈液体培养基，30 35 C培养18 24小时2麦康凯液体培养基，42 44 c培养24 48小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035c培养1872小时若麦康凯琼脂培养基平板上后菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验 ,确证是否为大 肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没启菌落生长， 或虽由菌落生长但鉴定结果为阴性， 判 未检出大肠埃希菌。4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：标准：阳性对照和试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照应无菌生长。结果判定：验证人：复核人：日期：日期：备注：采用以上供试液制备方法，分别对需氧菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查法进行方法验证时，若结果不能达到各标