材料论文谈依达拉奉对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及基因表达的影响

1、材料论文|谈依达拉奉对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及基因表达的影响    血管性痴呆(VD)是多种因素参与的复杂病理过程，而线粒体氧化损伤起重要作用1。细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)是线粒体电子传递链上的末端酶，也是电子传递链限速酶，在细胞能量代谢过程中起关键作用。神经元功能活动与COX活性密切相关。国内外尚未见应用自由基清除剂依达拉奉治疗VD的研究。故本实验通过观察依达拉奉对VD大鼠COX的影响，探讨其对VD大鼠的保护作用。  1 材料与方法, w: h4 4 Y' j 1.1 材

2、料 雄性Wistar大鼠，体重300350 g，由吉林大学实验动物中心提供。RNA prep培养细胞总RNA提取试剂盒、组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。One Step RNA PCR Kit购自TaKaRa公司。其余试剂为国产分析纯。/ h3 3 f. ?3 G( u4 S( C$ n. I1.2 动物模型的制备及分组 采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备慢性前脑VD大鼠模型2。将VD模型鼠分为：依达拉奉(商品名必存，南京先生药业公司)组(皮下注射，每日1次，3 mg/kg体重);甲磺酸阿米三嗪(都可喜)组(灌胃，每日1次，20 mg/kg体重)和模型组(灌胃，每日1

3、次，同容量生理盐水)，各10只。另取10只鼠为正常对照组(灌胃，每日1次，同容量生理盐水)，除不结扎、不剪断双侧颈总动脉外，其余过程与模型大鼠相同，以减少手术损伤造成的误差。各组大鼠手术7 d起给药，共20 d后取1及2个月为时间点，处死取脑。) h! c" x1 z! |# Y) G9 P. j 1.3 大鼠海马组织线粒体COX活性检测 取1 h内新鲜海马组织约0.5 g提取线粒体。在冰浴中剪碎，加分离介质约58 ml(成分为25 mmol/L 蔗糖，75 mmol/L 甘露糖，50 mol/L 乙二胺四乙酸钾盐(EDTAK)，10 mmol/L TrisHCl，0.1 mol/L

4、 KCl，并加入肝素50 U/ml，pH调至7.2)，在冰浴中匀浆。制备好的肌匀浆在0下4 500 r/min离心5 min，留取上清。在0下10 000 r/min离心20 min，得到棕灰色沉淀少量，再用洗液(成分为25 mmol/L蔗糖，75 mmol/L甘露糖，50 mol/L EDTAK，0.1 mol/L KCl，pH调至7.4)洗2遍，离心后悬浮于0.3% 0.4 ml的分离介质中备用。按文献3的方法进行COX活性检测。取pH7.4的200 nmol/L的KH2PO4 0.5 ml，加入双蒸水0.375 ml，2%(V/V)TritonX100 25 l，线粒体蛋白67 l(约2

5、030 g)和细胞色素C 33 l(20 mg/ml，用前以过量Vit C还原A550/A565>12)，用紫外分光光度计测定550 nm处细胞色素吸收值A的变化。2 9 '9 G2 n% j- S2 Z  m* O 1.4 RTPCR检测线粒体COX的表达情况 按说明书操作。反应结束后，取PCR反应液(510 l)进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增产物。用TAE(40 mmol/L TrisHAc，1 mmol/L EDTA)热溶解0.8%1.2%琼脂糖凝胶，稍冷后加入EB，铺胶。DNA溶液中加凝胶加样缓冲液(61)上样电泳，电泳缓冲液也用1×

6、TAE，电压为15 V/cm。电泳结束后，凝胶内DNA于紫外灯下观察并拍照。1 L5 A2 _! g7 n4 L2 y; ?( '1.5 大鼠海马组织线粒体COX基因突变分析 提取组织基因组DNA并进行PCR扩增引物设计。根据GenBank登陆的大鼠mtDNA基因组(登陆号：X14848)全序列设计PCR扩增引物。COX在mtDNA基因组的位置是nt6 9917 674，设计3对引物;COX在mtDNA基因组的位置是nt8 5849 367，设计3对引物(表1)。PCR反应结束，取5 l PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因扩增结果。琼脂糖凝胶回收目的基因片段。切胶时请注

7、意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA回收率。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。对所测得的序列在GenBank上进行BLAST，分析突变位点。表1 PCR扩增引物; N& d7 X% B# R& j 1.6 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS14.0统计软件进行单因素方差分析。; k9 Y, S: j( y% E2 结 果* c- A# D* Q5 Q 2.1 各组大鼠海马线粒体COX活性的影响 对各组大鼠海马组织线粒体后COX活性检测结果显示：术后1、2个月依达拉奉治疗组COX活性显著高于相应时间点

8、模型组(P<0.05)，并有高于都可喜组的趋势。见表2。表2 各组大鼠海马组织COX活性的影响与模型组同时间点相比：1)P<0.05;与治疗前比较：2)P<0.01$ 3 8 W, X) u; Z7 W  2.2 各组大鼠海马线粒体COX基因表达的影响5 '1 I& n3 P; J% q8 r& _! u, d 2.2.1 RTPCR分析线粒体COX的表达 提取组织总RNA后，进行RTPCR，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在295 bp处出现阳性电泳带，依达拉奉治疗组表达量高于模型组，与都可喜组比较无差异。内参照为bactin。见图1。

9、3 j" m" z% m' T) A.正常对照组;B.模型组;C.都可喜组;D.依达拉奉组;E：DNA marker(DL2000); C2 e& z5 u* c  M& T: I' - z图1 各组大鼠海马线粒体COX的表达/ Q5 b% E* # t. j* u$ 2.2.2 COX基因突变分析) Z; K$ t9 E' R2.2.2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析 以基因组DNA为模板，用相应片段引物进行PCR扩增，各组大鼠海马COX和 PCR扩增产物如图2，片段大小在300400 bp左右。- f2 3

10、X' & m2.2.2.2 COX 和基因分析 应用NCBI的BLAST 2 SEQUENCES RESULTS VERSION BLASTN 2.2.16分析软件，将所测的每一个样本的序列与GenBank登陆的mtDNA 进行比对分析。查找、分析基因变异位点，从表3可见,模型组COX基因有5处突变，与正常对照组比，新出现2处突变，是碱基替换，7 082位的TG，氨基酸由ValGly，7 144位的CG，氨基酸由HisAsp，比正常对照组少了4个突变位点;依达拉奉组新出现3处基因突变，比正常对照组少3个突变位点。与模型组比，依达拉奉组新出现3处基因突变，少3处突变位点。与正常对

11、照组比，模型组COX基因新出现2个突变位点，是碱基替换，其中有1处是无义突变，另一处是8 641 GGACGA，氨基酸GlyArg，但比正常对照组少了1个突变位点。依达拉奉组新出现2个突变位点，突变频率减少，没有对照组的突变位点。与模型组比，依达拉奉组没有模型组的突变位点，也没有正常对照组的突变位点。都可喜组而COX基因突变频率较高既有正常对照组的突变位点，也有模型组的突变位点。表3 各组大鼠海马组织线粒体COX和基因突变的影响 ( A' A1 h3 w  L& T* P 正常对照组COX COX模型组COX COX都可喜组COX COX依达拉奉组COX C

12、OX7 026 GCTGCC: j# a+ % S: , J 无义突变9 171 ATTCTT5 1 L0 x  M8 _3 i 无义突变7 026 GCTGCC3 t, p& d# 6 O: K4 a 无义突变8 640 ACAACG  S9 A4 L4 E% P+ f$ b 无义突变7 026 GCT& ! O' U: c) R8 A, f$ ( _ GCC无义突变8610 TAT: E8 A$ x. Z  ?4 j GATGluTyr7 018 CAAGAA8 616 AAC1 U1 9 L( O% _+

13、 j3 B- M- X9 M AGCAsnSer7 132 ACAGCA  '" v- |- '* v! D. " MThrAla9 182 AGCAGA5 : d  W9 ! d" O9 O' b4 P SerArg7 082 GTAGGA) / ( |" , b$ Q9 p& z7 m& ' r ValGly8 641 GGACGA+ P/ F5 - Z1 a: q) '# u$ V3 g GlyArg7 082GTA. y" W, S; N#

14、x) S# Z. ; GGAValGly9171 ATT; N( I3 d3 p3 h: # g4 C0 vCTTIleLeu7 026 GCTGCC$ _/ L$ S8 T5 P4 j4 R& h无义突变8 846 GTC! V( I+ Z; a$ c+ |8 YGCCValAla7 149 ACAACG& F3 r2 f! '. F2 f6 无义突变9 396 CTT. x; P) N" B4 x! B GTTLeuVal7 132 ACA: $ # k0 ! _' D% oGCAThrAla9 182 AGC1 S6 C5 3 d7 ?: NAG

15、ASerArg7 132 ACA( l+ / C9 F5 z, GCAThrAla9 182 AGC2 p; w# H7 e$ N; K' pAGASerArg7 040 ATAAAA# m0 F+ v7 m) a  b: R, X IlelY7 180 CAACAT& J9 q3 W+ G6 a" b  t GlnHis7 144 CACGAC- T) z! K8 R* c& J7 F HisAsp7 144 CACGAC: ?5 A+ P7 J/ D. E5 O HisAsp9396 CTT7 W$ z9 q/ Z-

16、 O* g/ E GTTLeuVal7 082 GTA1 d, G! j& h+ BGGAValGly7 189 CAACAT2 Y3 y4 q$ J0 H& '0 s% w8 Y0 iGlnHis7 149 ACAACG5 s- z% y( k) y, c 无义突变7 149 ACAACG' U' L( R0 R* t  i- X/ x$ f无义突变9397 CTT7 w' b/ B  u  x5 e1 Y5 'GGTLeuGly7 149 ACAACG$ r" 4

17、z4 o( W$ Y! 无义突变7 199 CTGTTG  ) T, ( q1 U& 无义突变7 385 TGA) Z: ' u9 2 ; F+ MGTTSTOPVal7 151 ACA1 G  # W" j2 c& n- b CCAThrPro7 339 TAGTAA" i* q5 _8 ?+ X1 " y无义突变7 386 ACT7 A! % K. x! d4    GCTThrAla7 429 AGAACA0 I: I# C/ o% G; j9 E0 N  

18、;t# j5 z: l. rArgThr* h* O4 c# '( x/ T, Q A：正常对照组COX1，B：模型组COX1，C：都可喜组COX1，D：依达拉奉COX1，E：正常对照组COX2，F：模型组COX2，G：都可喜组COX2，H：依达拉奉COX2，Mk：DNA Marker(DL2000)，I：正常对照组COX3，J：模型组COX3，K：都可喜组COX3，L：依达拉奉COX3，M：正常对照组COX4，N：模型组COX4，O：都可喜组COX4，P：依达拉奉COX4，Q：正常对照组COX5，R：模型组COX5，S：都可喜组COX5，T：依达拉奉COX5，U：正常对照组COX6，

19、V：模型组COX6，W：都可喜组COX6，X：依达拉奉COX6，Mk：DNA Marker(DL2000)/ X' Y, j3 m1 e1 e- m( O9 E( C 图2 PCR扩增COX、COX基因片段结果3 m+ S3 w( J# o( G- W) M2 t 3 讨 论: c, Z1 u, C: 6 V5 # U0 V脑组织富含线粒体(mitochondria)，既是细胞呼吸和能量代谢的重要场所，又是氧自由基产生的主要部位。由于脑组织有较多的不饱和脂肪酸，耗氧量大，而抗氧化酶活性相对较低，因此易遭受自由基的氧化损伤。大量自由基一方面可引起线粒体结构和功能受损，影响丙酮酸脱氢酶的活

20、性，使葡萄糖的氧化分解发生障碍，乙酰胆碱合成不足4，导致痴呆患者学习记忆呈渐进性减退;另一方面，大量自由基还可损伤线粒体DNA(mtDNA)，导致其编码的呼吸链复合物酶蛋白亚基表达下降，酶活性降低，进一步危害能量代谢机制5。而线粒体又是细胞的能量代谢中心，已有许多研究报道，缺血时线粒体发生肿胀、变性、空洞化、数量减少等一系列退行性改变，因而线粒体被认为在细胞缺血中具有重要的作用6，7。COX是细胞色素类物质，是线粒体的标志酶之一，定位于线粒体内膜，是呼吸链集合体中电子传递链的末端酶及关键酶。与有氧代谢及内呼吸密切相关，其活力直接影响线粒体氧化磷酸化过程，能真实地反映脑的能量代谢，是一个具有高敏

21、感性、可信性和可重复性的内源性代谢标记物。有研究表明，其活力下降会造成神经细胞氧化磷酸化功能障碍和ATP合成减少8。缺氧时，COX等有氧代谢酶系活性下降9。其原因是由于线粒体损伤，海马细胞中线粒体进行氧化磷酸化、合成ATP的能力下降，其内酶扩散至胞液或进一步扩散到细胞外，从而导致活性下降;或由于细胞缺氧，电子传递链不能及时将电子传给O2·，以及电子传递链上的COX等蛋白质停滞于还原状态所致10，11。本研究结果显示：依达拉奉治疗后COX活性及COX表达量较模型组显著增加。模型组COX基因有5处突变，与正常对照组比，新出现2处突变，是碱基替换，7 082位的TG，氨基酸由ValGly，7 144位的CG，氨基酸由HisAsp，比正常对照组少了4个突变位点;依达拉奉组新出现3处基因突变，比正常对照组少3个突变位点。与模型组比，依达拉奉组新出现3处基因突变，少3处突变位点。与正常对照组比，模型组COX基因新出现2个突变位点，是碱基替换，其中有1处是无义突变，另一处是8 641 GGACGA，氨基酸