微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证

1、GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证题目微生物限度检查用及环境监测用培 养基的配制、火困和贮存效期验证类另U技术标准编码STP-WJ001-02版次第1版制定人审核人批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量部发布日期生效日期分发部门制定依据药品生产质量管理规范（2010年修订）变更历史起草 修订口原编码：变更原因药品生产质量管理规范变更目的：本试验通过对微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制方法、灭菌程序以及配制后贮存条件和贮存效期进行验证，确保每次配制的培养基质量均满足2010年版中国药典要求。适用范围：适用于微生物限度检查用及环境监测用培养基。责任人

2、：质监部经理、QC主任、QC人员内 容：1. 概述：3次独立试验中确定了培养基的配制方法、灭菌参数、贮存条件（2-25 C）及贮存时间（30天），并对贮存0天、7天、15天和30天的培养基进行适用性检查（包括促生长能力、抑制能力、指示能力和无菌性）。培养基是否合格，对微生物的生长、分离、鉴定及检验结果的正确与否起着至关重要的作用， 因此，对培养基的质量控制十分必要。适宜的培养基制备方法，合理存放，以及质量控制试验，是 提供优质培养基的保证。2005年版中国药典还没有规定对培养基进行适用性检查，经过修订，2010年版中国药典不但规定了培养基需进行适用性检查，而且在2010年版中国药典（一部 附录

3、）中规定： 若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查实验可只 进行一次，如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验”。本次验证试验的目的就是通过验证规范培养基的配制和灭菌过程，使培养基的整个配制和灭菌过程受控，同时确定培养基的贮存条件和贮存效期。2. 材料与仪器设备Q A 拉圭苴2.1 培养基2.1.1. 试验用培养基：营养琼脂培养基（批号 121010）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号1302172）、胰酪胨大豆琼脂培养基（批号1112092 ）、胆盐乳糖培养基（批号 1209162 ）、营养肉汤培养基（批号120912）、四硫磺

4、酸钠亮绿培养基（批号130124）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（批号 121023）均由北京三药科技开发公司生产；2.1.2. 对照培养基：营养琼脂对照培养基（批号 135003-201103 ）、玫瑰红钠琼脂对照培养基（批号135005-201002 ）、胰酪胨大豆琼脂对照培养基（批号 135025-201101 ）、胆盐乳糖对照培养基（批号 135006-201203 ）、营养肉汤对照培养基（批号 135004-201103 ）、四硫磺酸钠亮绿对照培养基（批号135020-201101）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸对照培养基（批号 135012-201001 ）均中国药品生物制品 检定所提供

5、。22 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli ） CMCC（ B）44102；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ） CMC（ B） 26003 丨；乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B） CMCQ B） 50094；枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis ） CMCQB） 63501 丨；白色念珠菌 （Candida albicans ） CMC（ F） 98001；黑曲霉（Aspergillus niger ） CMCQF） 98003 以上菌种均购自贵州省食品药品检验所。2.3. 仪器设备医用型洁净工作台（苏州安

6、泰空气技术有限公司）；标准型洁净工作台（苏州净化设备厂） ；电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械一厂）；生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；JJ200型电子天平（常熟双杰测试仪器厂）；立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；电热恒温水浴锅（天津市泰特仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；漩涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；格兰仕微波炉（顺德市微波炉电器有限公司）；电冰箱（河南新飞电器有限公司）。3. 方法和结果3.1. 试验环境试验在洁净度为A级的单向流空气的洁净操作台进行，其环境洁净度为C级。检验过程严格遵守无菌操作。3.2. 培养基的配制方法和灭菌参

7、数3.2.1. 培养基的选择：分别随机抽取接近效期的脱水培养基各3瓶，按照2010年版中国药典培养基适用性检查中规定的方法， 试验分别进行3次独立试验，每次从培养基中各选取 1瓶进行试验。3.2.2 .配制方法：按照培养基包装上的配制说明配制，将培养基分别分装在锥形瓶中，用硅胶塞塞 紧瓶口，并用硫酸纸包扎。四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）分装于试管中，10ml/管，包扎；MU分装于试管中，5ml/管，包扎。2.2.3灭菌参数：配制、包扎好的培养基，装入立式压力蒸气灭菌器中，以验证的灭菌程序进行灭 菌，灭菌后测pH直。3.3. 灭菌后培养基的贮存和贮存后使用方法3.3.1. 贮存条件：灭菌后的培养

8、基放冷后，置于2-25 C冷藏柜密闭贮存 30天，每天记录冷藏柜温度。3.3.2. 贮存后的使用方法：灭菌贮存后的已经凝固的固体培养基，使用前，先于微波炉中融化，待培养基完全融化后，置于 45 C左右的恒温水浴锅中，待培养基温度达到45 C后使用；火菌贮存后的液体培养基可直接使用。3.3.3. 贮存时间、适用性检查项目和试验菌种：分别选取灭菌后贮存0天（即刚灭菌后未凝固的培养基）、7天、15天、30天后的培养基进行适用性检查，检查项目和试验菌种见表1。表1各类培养基的适用性检查项目培养基名称检查项目（英文缩写）无菌性促生长能力抑制能力指示能力营养琼脂培 养基 （NA）玫瑰红钠琼脂培 养基 （R

9、BA）试验菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌大豆酪蛋白琼脂培养基（TSAVVxx曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)VVxVMU培养(MUG)VVxV乳糖胆盐培养基（BL）VVVx营养肉汤培养基VVxx四硫磺酸钠亮绿培养基（TTBVVVx注：V为考察项；x为不考察项。34菌悬液的制备参照2010年版中国药典附录中的方法制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和乙型副伤寒沙门菌的菌悬液，用无菌的0.9%氯化钠溶液制成1ml含菌数为5

10、0100cfu的菌悬液。并用营养琼脂对照培养基测定各试验组中加入的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和乙型副伤寒沙门菌的数量。用玫瑰红钠琼脂对照培养基测定各试验组中加入白色念 珠菌、黑曲霉的数量。3.5.培养基适用性检查的试验方法及结果 3.5.1.营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基促生长能力检查:按照表1中的检查项目，取上述制备的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念凝固后，营养琼脂培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基置 28C培养72h;培养结束后各平板平均菌落数。从表 琼脂培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基上的平均菌落数和 均菌落数均不小于相应对照培养基上菌落平均

11、数的3035C培养48h;玫瑰红钠琼脂培养基置 232可以看出，3次试验中3种试验菌在被检营养2种试验菌在被检玫瑰红钠琼脂培养基的平70%且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一珠菌、黑曲霉的菌悬液各 1ml （含菌数50100cfu ）,分别注入无菌平皿中，立即倾注对应的被检培 养基和和对照培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（2个被检培养基和 2个对照培养基），混匀,第4页共8页GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证第#页共8页GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证致。EMB固体选择性培养基促生长能力和指示能力检查:第#页共8页

12、GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证分别取大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的菌悬液O.ImL （含菌数1O-1OOcfu，测定结果见表3）涂布于被检EMB平板上，在3035C培养18h。从表4可以看出，3次试验中试验菌在被检培养基 上生长良好，其菌落大小、形态特征、指示反应情况均符合大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的典型 特征。3.5.2. MUG液体培养基促生长能力和指示能力检查：取大肠埃希菌菌悬液1mL （含菌数不大于100cfu，测定结果见表 3）接种到5ml被检MUGKMUG在 3035C培养5h后观察现象，结果3次试验中试验菌在两种被检液体培养基中生长良好

13、，培养基变浑浊，于365nm紫外光下呈现荧光反应，见表4。3.5.3. BL 液体培养基促生长能力和抑制能力检查：取大肠埃希菌菌悬液 1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）接种到1瓶100ml被检BL 中，置3035C培养18h后观察现象；取金黄色葡萄球菌菌悬液2ml （不少于100cfu，测定结果见表3）接种到另1瓶100ml被检BL中，置3035C培养24h后观察现象，结果（见表 4）。3次试验 中大肠埃希菌在被检培养基中生长良好，培养基变浑浊；金黄色葡萄球菌在被检培养基中被抑制， 不生长，培养基澄清。3.5.5 .营养肉汤培养基促生长能力检查：取乙型副伤寒沙门菌菌悬液 1mL

14、（含菌数不大于 100cfu ,测定结果见表 3）分别接种到100ml 被检营养肉汤培养基和对照营养肉汤培养基中，置3035C培养18h后，与对照培养基比较； 3次试验中乙型副伤寒沙门菌在被检培养基中生长良好，培养基变浑浊；培养48h后，空白培养瓶澄清。3.5.6. 四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）促生长能力和抑制能力检查：取5支（10ml/支）的对照TTB培养基，分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌菌悬液 1mL （含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）各2支，另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基 同法操作，置3035C培养18h后，与对照培养基比较；3次试验中乙型副伤寒沙门菌在被检

15、培养基中生长良好，培养基变浑浊；培养24h，空白的培养管和接种金黄色葡萄球菌的培养管澄清。3.5.7. 无菌检查试验：培养基灭菌后，不接种任何样品，在对应的培养条件下培养。从表3和表4中各培养基的无菌性可以得出，固体培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基和EMB无菌落生长；液体培养基（营养肉汤、BL、四硫磺酸钠亮绿培养基和MUG澄清，与空白对照一致，均满足无菌要求。第5页共8页GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证表2 宫养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基适用性检查结果营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基大豆酪蛋白琼脂

16、培养基组次贮存时间促生长能力检查无菌促生长能力检查被检培养基平均菌落数无困AU-.-LA 【宀AA*促生长能力检查被检培养基平均菌落数 (cfu)/对照培养基平被检培养基丨均 困落数(CTU)/对照培养基丨均 困无困均菌落数(cfu)/菌液回收率性检查(CTU)/ 对照培养基平均困 落数(cfu) /菌液回收率性检查落数(cfu)/菌液回收率性检查大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌0天81/84/96%70/73/96%83/84/99%(-)63/67/94%51/54/94%(-)81/86/94%74/75/99%74/75/99%(

17、-)17天64/71/90%78/84/93%70/72/97%(-)62/73/85%59/64/92%(-)81/86/94%80/81/99%80/81/99%(-)15天70/73/96%81/86/94%74/75/99%(-)55/56/98%53/59/90%(-)94/95/99%68/60/113%65/70/93%(-)30天83/92/90%74/81/91%81/86/94%(-)69/73/95%62/63/98%(-)82/78/105%71/74/96%76/77/99%(-)0天70/77/91%79/83/95%73/75/97%(-)74/82/90%56/

18、63/89%(-)80/79/101%68/72/94%84/93/90%(-)27天62/69/90%71/75/95%72/78/92%(-)65/66/98%67/70/96%(-)85/90/94%76/80/95%90/91/99%(-)15天76/80/95%68/72/94%62/72/86%(-)57/61/93%58/62/94%(-)80/78/103%68/71/96%84/91/92%(-)30天75/79/95%59/67/88%58/66/88%(-)57/62/92%59/66/89%(-)64/64/100%77/74/104%88/89/99%(-)0天80/

19、81/99%74/77/96%80/82/98%(-)57/62/92%52/55/95%(-)61/65/95%76/77/99%90/91/99%(-)37天77/82/94%79/83/95%67/72/93%(-)67/73/92%60/62/97%(-)85/89/96%66/70/94%81/85/95%(-)15天66/67/99%77/80/96%68/71/96%(-)66/70/94%57/59/97%(-)72/79/91%90/90/100%82/90/91%(-)30天63/67/94%78/82/95%72/75/96%(-)55/58/95%55/59/93%(-

20、)78/78/100%82/84/98%59/63/94%(-)注：(+)表明无菌性检查平板上有菌落生长；(-)表示无菌落生长;表3 BL、MUG EMB营养肉汤和四硫磺酸钠亮绿培养基各试验组加入的试验菌测定结果组次贮存时间BLMUG稀释度平均菌落数(cfu)大肠埃希菌EMB稀释度平均菌落数(cfu)营养肉汤稀释度平均菌落数(cfu)四硫磺酸钠亮绿培养基 稀释度平均菌落数(cfu)稀释度平均菌落数(cfu)大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌萄金黄色葡球菌0天10-78410-713710-78410-67310-78810-76810-71427天10-7711

21、0-715610-77110-68210-77810-77710-7156115天10-77310-716210-77310-67010-79010-77210-7172-7-7-7-6-7-7-730天1092101591092108710921080101800天10-77710-716210-77710-66910-78410-78610-7162o7天10-76910-714610-76910-67010-76910-77810-7155215天10-78010-714510-78010-67510-78610-76910-713830天10-77910-713710-77910-67

22、410-77210-76810-71370天10-78110-714910-78110-68210-79610-77210-7150-7-7-7-6-7-7-77天1082101631082107810821069101783-7-7-7-6-7-7-715天10671014610671074108310771014030天10-76710-715910-76710-66910-79410-77510-7166第7页共8页GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证表4 BL、MUG EMB营养肉汤和四硫磺酸钠亮绿培养基适用性检查结果EMB营养肉汤四硫磺酸钠亮绿培养

23、基组贮存促生长能力抑制能力次时间大肠埃希菌金黄色葡萄球菌BL0天（+）（-）1 7天（+）（-）15天（+）（-）30天（+）（-）0天（+）（-）7天（+）（-）215天（+）（-）30天（+）（-）0天（+）（-）7天（+）（-）315天（+）（-）30天（+）（-）无菌性检查促生长能力大肠埃布菌指示能力大肠埃希菌（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)MUG无菌性检查大肠埃布菌乙型副伤寒沙门菌(-)(+)(+)(-

24、)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)促生长能力无菌性检查促生长能力大肠埃布菌无菌性检查(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)促生长能力乙型副 伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌无菌性检查(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(

25、-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)第8页共8页GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证注：（+ ）试验菌生长良好，培养基浑浊；（-）试验菌被抑制，不生长，培养基澄清;第#页共8页GMP文件一微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证4. 结论按照3.2.2.项下方法配制营养琼脂培养基、 玫瑰红钠琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基、BL、 MUGEMB营养肉汤和四硫磺酸钠亮绿培养基， 以相应程序和灭菌参数进行灭菌后， 贮存于225C 的冷藏柜中，分

26、别在贮存 0天、7天、15天和30天时对培养基的适用性进行考察，试验结果表明 3 次独立试验中，贮存 30天内的培养基，无菌性、促生长能力、指示能力和抑制能力均符合2010年版中国药典规定，为了更有把握地确保培养基的质量，确定以上培养基的贮存有效期为15天。5. 讨论.5.1. 人员对培养基贮存效期验证的影响不同实验人员的操作，特别是配制过程和贮存过程的操作，会对每批培养基质量的一致性产生 影响。验证之后将配制、灭菌、贮存和使用的操作方法详细规定在培养基配制、灭菌、贮存和使 用的标准操作规程文件中，指导操作；验证中的 3次独立操作由不同的实验人员来进行；为确保 验证方法操作的一致性，对相关人员进行培训