固定化酵母细胞发酵啤酒的初步研究

1、随着生物工程技术的发展,应用固定化酵母细胞发酵生产啤酒,是当前啤酒生产工艺的重大改革和发展方向。固定化细胞具有生长快、反应快、抗污染能力强、可连续使用、有利于产物分离的特点,越来越广泛地应用于食品与发酵工业中1。海藻酸盐大量应用于酵母的固定化,可实现连续化生产,提高产品的转化率和生产效率2。据国内外文献报道,选用最优的保麦载体海藻酸钠为载体,首先对固定化条件进行研究,在最佳固定化条件下,对发酵啤酒的工艺条件进行了优化,确定了最佳发酵条件,对固定化酵母的发酵性能有了更加深入的了解,为进一步实现固定化酵母的连续发酵啤酒创造条件。1材料1.1菌种啤酒酵母:安琪公司。1.2培养基斜面培养基:12

2、76;P麦芽汁+2%琼脂;酵母扩大培养基:12°P麦芽汁;固定化酵母发酵培养基:12°P麦芽汁。1.3试剂海藻酸钠,CaCl2,乳酸,酒花,大麦芽。2方法2.1麦芽汁的制备方法麦芽粉碎糖化过滤加酒花煮沸分离调整糖度2.2固定化细胞的制备方法海藻酸钠固定方法3-4:将活化后的酵母接种液体试管,28培养24h。再以10%的接种量接种摇瓶液体培养基, 28培养24h。取适量培养液10000r/min离心10min,倾去上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体,离心后得湿菌体。称取一定质量的湿菌体,将菌体细胞加入2%6%(w/v的海藻酸钠溶液,充分混匀。将海藻酸钠菌体悬液移入10mL 注射器

3、中,适度加力,将海藻酸钠菌悬液滴入CaCl2溶液中(37水浴。滴完后将三角瓶移入2022水浴中放置1h。倾去溶液,加入100mL无菌去离子水冲洗1次。重固定化酵母细胞发酵啤酒的初步研究李娜,李树立,郭忠鹏(河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄050061摘要:对啤酒酵母细胞的固定化条件进行了研究,使用不同浓度的海藻酸钠与不同浓度的氯化钙反应包埋酵母细胞,分批发酵的结果表明:用2%海藻酸钠与4%的氯化钙反应所制得的固定化细胞能够达到最佳的效果,发酵性能和机械强度均达到最佳化。以最佳固定化条件固定啤酒酵母细胞进行啤酒发酵,研究其最佳的发酵条件,结果表明:采用接种温度810,主发酵温度1315

4、,pH4.3,填充量0.45g/mL时,发酵速度快,双乙酰含量低。易酿成淡爽型风味良好的啤酒。关键词:固定化细胞;啤酒酵母;发酵中图分类号:Q814.2;TS262.5文献标识码:A文章编号:2054-0571(200709-0018-04Primary study on beer fermentation by immobilized yeastLI Na,LI Shu-li,GUO Zhong-peng(College of Biological Sciences and Bioengineering,Hebei University of Economic Trade,Shijiazhu

5、ang,050061,ChinaAbstract:The batch fermentation in beer production was performed using immobilized yeast cells by sodium alginate and calcium chloride. The immobilization and fermentation conditions were studied.The results indicated that when2%sodium alginate and4%calcium chloride were used for imm

6、obilization,the optimal conditions of fermentation were as follows:inoculation at810,primary fermentation at1314,pH4.3,and filling fraction of0.45g/ml.Under the conditions,the speed of fermentation was improved,while the concentration of diacetyl was reduced,which was helpful for the production of l

7、ight beer with nice flavor.Key words:immobilized cell;Saccharomyces cerevisiae;fermentation收稿日期:2007-02-06作者简介:李娜(1965-,女,河北辛集人,高级工程师,研究方向为微生物资源与发酵工程。图1不同温度对发酵速度和双乙酰产生的影响Figrue 1.Effects of different temperatures on fermentation speed and 双乙酰production表1海藻酸钠与CaCl 2对胶粒强度及发酵的影响Table 1.Effects of sodiu

8、m alginate and calcium chloride on themechanicalstrength ofgelgranules项目63677478828585833.53.7残糖量/%实验组数123456789新加入50mL 0.6%CaCl 2溶液,4平衡过夜。2.3测定标准残糖测定:糖度计测定法。酒精含量测定:蒸馏-比重法。双乙酰(VDK 含量的测定:紫外分光光度法测定。包埋菌数测定:取一定数量固定化颗粒,用一定量的5%柠檬酸钠彻底溶解后,适当稀释,显微镜下血球计数板计数。发酵速度的测定:发酵速度=(起始糖量-残糖量/发酵时间固定化细胞机械强度测定:取100粒固定化细胞颗粒在

9、相同条件下,加50粒玻璃珠,转速170r/min 振荡4h 后计算完整率:完整率=(振荡后完整的细胞颗粒/100×100%3结果与分析3.1不同浓度海藻酸钠与氯化钙对胶粒强度及发酵的影响按0.2g/mL 填充量(4g 湿菌体加入到20mL 包埋剂海藻酸钠溶液中,以2%、2.5%、3%的海藻酸钠菌悬液分别与2%、3%、4%的CaCl 2溶液进行凝胶化,将固定化细胞置于200mL 麦芽汁中,测定所得的固定化酵母颗粒的强度和在912发酵7d 后的酒精产量与残糖量。实验结果见表1。从表1可以看出,以2%海藻酸钠与4%氯化钙形成的凝胶固定化效果最好,912连续发酵,机械强度下降缓慢,使用性能好

10、。Ca 2+是决定海藻酸钙固定化酵母机械强度的重要因素,随着Ca 2+浓度的增加,固定化酵母的强度增加,较低的海藻酸钠浓度使凝胶相对渗透性能好,有利于底物的进入和产物排出5,因此,利于酵母细胞的发酵作用,故选择2%海藻酸钠与4%氯化钙为固定细胞的最佳条件。3.2固定化酵母发酵条件的优化研究以2%海藻酸钠与4%氯化钙固定啤酒酵母细胞,进行啤酒发酵条件的优化。温度对固定化酵母发酵的影响6:按0.2g/mL 填充量,将固定化细胞置于200mL 麦芽汁中,温度选择在515,pH5.4,起始糖度12°P ,发酵7d 。通过测定不同温度下的发酵速度,研究温度对固定化酵母发酵的影响,结果见图1A

11、。温度对酵母的生长繁殖、酒花酶活力、发酵速度与周期、杂菌污染等影响较大7。由图1A 可知,当温度低于7时,固定化酵母发酵速度较慢,5以下极度缓慢,甚至停滞,高于7后,随着温度的升高,发酵速度逐渐加快,发酵周期符合生产要求。根据温度的不同,啤酒发酵分为低温发酵(79、中温发酵(1012、高温发酵(13153种发酵方式,为了缩短发酵周期工业上较多采用中温发酵。选择上述3个不同温度分别代表3种发酵方式作为研究对象,在pH5.4、填充量0.2g/mL 、起始糖度12°P 的条件下,发酵7d 。通过测定不同发酵温度下的VDK 含量,研究温图2pH 值对发酵速度、双乙酰产生的影响Figure 2

12、.Effects of pH on fermentation speed and 双乙酰productionAB度对固定化酵母发酵啤酒中的VDK 影响,结果见图1B 。由图1B 可知,VDK 含量在高温发酵时的峰值最大,温度高VDK 还原速度快,发酵结束时VDK 含量低于其他温度。但随着温度的继续升高,固定化细胞株的机械强度减弱,因此温度不宜过高,采用发酵温度1315,发酵周期短,相同贮酒期可以酿成爽口、细腻的啤酒。pH 值对固定化酵母发酵的影响:选择pH 值在3.06.0,温度1315,0.2g/mL 填充量,起始糖度12°P ,发酵6d 。通过测定不同温度下的发酵速度和VDK 含

13、量,研究pH 值对固定化酵母发酵的影响,结果见图2A 。pH 值的控制应考虑酵母发酵和发酵的最适pH 值、防止杂菌污染。由图2A 可见,当pH 值较低或pH>5时,酵母细胞活力下降,固定化酵母细胞最佳发酵pH 值为4.05.0,此时酵母可正常发育和发酵。由图2B 可见,在pH4.5条件下,VDK 还原迅速,发酵结束时的含量较低,经后酵啤酒风味纯正、爽口。填充量对固定化酵母发酵啤酒的影响:选择填充量在0.1g/mL0.5g/mL ,温度1315,起始糖度12°P ,发酵5d 。通过测定不同填充量下的发酵速度和VDK 含量,研究填充量对固定化酵母发酵的影响,结果见图3A 。图3填充

14、量对发酵速度、双乙酰产生的影响Figure 3.Effects of cell filling amount on fermentation speed and 双乙酰productionAB由图3A 可知,填充量越大,酵母细胞含量越多,发酵速度越快,填充量继续增加,发酵速度反而下降,经研究发现,酵母浓度过高,易造成无氧环境,影响酵母细胞的增殖,同时由于酒精含量的增加也对酵母的发酵发生抑制。由图3B 可知,随着填充量的增加,酵母细胞浓度和酵母的增殖速率也随之增大,因此VDK 的含量也增大,峰值较高,当填充量继续增大接近0.4g/mL 时,此时酵母细胞的增殖浓度降低,VDK 含量显著下降,峰值也

15、较其他条件的低,填充量继续增加VDK 含量变化不大,而发酵速度却随之下降,因此,填充量选择0.4g/mL 较为合适。以温度pH 值和填充量为因素,设计为L 9(34的正交试验8,正交试验因素水平见表2。以麦芽汁中糖的利用速度、发酵终了VDK 含量为指标正交试验结果见表3。由表3对发酵速度的极差分析可见,R C >R A >R B ,因此填充量对固定化酵母的发酵速度的影响最为显著,其次为温度和pH 值。由表3对VDK 含量的极差分析可见R A >R C >R B ,因此温度对啤酒中VDK 含量的影响最为显著,其次为填充量和pH 值。双乙酰河南省长葛市毛庄主力酿造厂现有以下

16、旧设备待处理:3m 3旋转蒸锅;板框压滤机(内框规格450mm ×450mm 和相配套螺杆浓浆泵一台。另该厂代培固体醋酿造技术,该法较传统工艺的劳动量减轻一半,煤耗减少1/3,风味与传统工艺一样,四季主粮平均出醋(国标二级10.5斤以上。联系电话:0374-*联系人:李振旗!设备信息!"""""""""""""""""""""""""&q

17、uot;"""""""""""""""""""""#""""""""""""$%$""""""""""""$确定最佳组合为A 3B 1C 3,即发酵温

18、度为1315,pH4.3,填充量为0.45g/mL 。低温810接种,降低酵母细胞增殖浓度,减少风味物质的形成,固定化酵母发酵速度快,发酵周期短,同时高填充量进一步降低了酵母增殖浓度,主酵期VDK 的含量低,温度高在后期加速了双乙酰的还原,消除了啤酒中的不愉快气味。4结论试验研究结果表明,以2%海藻酸钠与4%的氯化钙反应所制得的固定化细胞胶粒能够达到最佳的效果,发酵性能和机械强度均达到最佳化。采用L 9(34正交试验对固定化酵母发酵工艺条件进行研究结果表明,采用接种温度810,主发酵温度1315,pH4.3,填充量0.45g/mL 进行发酵,结果最佳。在此条件下发酵速度快,高填充量降低了酵母增

19、殖浓度,加速了VDK 的还原。研究为固定化酵母细胞发酵啤酒的工业化生产提供了理论依据,后酵的发酵条件有待于进一步研究。参考文献:1陈陶生,等.固定化酶理论与应用M.北京:轻工业出版社,1987:170-172.2CHEETHAM P S J,BLUNT K W,BUCKE C.Physical studies on cell immobilization using calcium alginate cells J.Biotech-nol Bioeng,1979(21:2155.3GRAURI S,MITTAL.Food Biotechnology Techniques and Ap-plication M.Canada:1992:148-153.4DAVID A R,CHARLES E,BONITA A G.Improved or