细胞工厂生产口服轮状病毒活疫苗的应用研究.docx

1、细胞工厂生产口服轮状病毒活疫苗的应用研究刘学平，魏至栋，谢澎，庞兴，任雅萍(兰州生物制品研究所，兰州730046)摘要：为了确定用细胞T厂生产口服轮状病毒活疫苗的工艺参数和质控点，将原代牛肾细胞按2010,个：接种到细胞工厂培养，待形成R好单层后按410,个/to:连续传代2次后接种轮状病毒，并与转瓶作对照果麻，用细胞工厂生产口服轮状病毒活疫苗与转瓶培养无差异，细胞工厂可用于改进口服轮状病毒活疫苗的生产。关键词：细胞工厂;牛肾细胞；轮状病毒疫苗中图分类号：R373-2文献标志码：A文章编号：1005-573(2011)04001304SajSTAiKLIUX-,WEI-,XIEP.(LIBP,

2、L730046.C)Aa:TodeterfiineCeparame&sandfietimepointofquaiitycorlrofofroGvirusvaccineliiatisproduoedtyCaf-STACK_TueautvationoffieprimarycaifiidncdtswasprocesedintieCdiSTACKandcomparedwitiitieciiiturehyroiie-b»tie.wasinoculatedintoceiswiientieaoodmornlayerwasifmtd_Tiiersuitsiiavedtuattieeisrnd

3、i"fcoiceeaitilequalityofvacdnspreducedwitiitwotecuniqus.tieCeiST/CKanbeusedfflaeproduefonofvaccine.K:CaiSTACK;BovineSidneycdf;Rotavirusvacine兰州生物制品研究所生产的U服轮状病毒活疫苗（LLR株）的细胞基质为新生小牛肾细胞m,培养容器为15L转瓶，由于转瓶占用外围空间较多，劳动强度较大，若用细胞工厂代替转瓶培养，将会提高生产厂房的使用效率，同时减少转瓶个体间的差异，可提高口服轮状病毒活疫苗质量的均性，此，对t-肾细咆在细胞工厂培养时的条件进行摸索

4、，并将细胞工厂与转瓶培养进行比较果表明，牛肾细胞按适宜密度接种到细胞工厂进行培养，在规定时间内能形成良好单层，口服轮状病毒活疫苗原液滴度与转瓶之间无差异材料和方法1材料1-1牛肾采自出生12d的健康小公牛1-2消化液0.2卵胰酶溶液，胰蛋白酶购自美国DFC0公收稿日期：2011-03-0*:修回日期：20ll-!0-16基金项目:国家科技支撑计划（200IBA1SB04-01）作者简介：刘学平（1973-）,男，大学本科，医学生物学高级工程师,主要从事材毒类疫苗的研究及生产工艺改进通信作者：翅至栋Te-mail：wzdsc163.con司，溶液自配。1-3培养液水解乳

5、蛋白-mem液（含小牛血清和庆大霉素），MEM和水解乳蛋白均为GEC0产品；小牛血清购自兰州荣晔生物科技有限责任公司；庆大霉素为安阳路德药业有限公司出品1-4细胞工厂美国CORNMG公司生产，每层培养面积为636on:;美国塞莫飞公司生产（NUNC）,每层培养面积为632on1.5转瓶（15L）四川万福玻璃仪器有限责任公司出品，有效培养表面积为28001王疫苗病毒株羊轮状病毒LLR毒株。1 -7实验用疫苗批号201003）4;20100601;20100607;20100801;201008022方法-1原代牛肾细胞的制备'J无菌摘取12d新生小牛肾，剪碎成0.S1-0mm小块后用胰蛋

6、白酶消化制备成细胞悬液，经活细胞计数后，按2010个E'分别接种到5层细胞工厂和15L转瓶上培养，经培养形成单层（成片率高于90%）为原代牛肾细胞（P0）。2.2传代牛肾细胞的制备原代牛肾细胞经培养形成单层后，吸去培养液，用0.2+胰酶-0.02%EDTA消化液进行消化凹，在消化液的作用下,细胞圆缩呈球形时终止消化，弃去消化液，加入少量含10%新生牛血清培养液收集细胞，轻轻摇晃，制成细胞悬液，经活细胞计数后按410'个/61'分别接种到10层细胞工厂和15L转瓶内培养（P1代），P1代细胞形成单层后再次消化，按410'个火分别接种到40层细胞工厂和1SL转瓶内培

7、养（R代）。2-3细胞计数方法13心采用台盼蓝染色法进行活细胞计数。2-4口服轮状病毒活疫苗原液制备P2代牛肾细胞培养形成单层后，用Ean-s液冲洗2遍，接种轮状病毒液，置于37孵房培养，待细胞发生病变后收毒2.5病毒滴度测定以CCDEA&法（半数细胞感染剂量-酶联法）,测定病毒的滴度。结果1牛肾细胞在细胞工厂上的生长情况以原代牛肾细胞按2010个接种到细胞工厂和15L转瓶内培养时,8d均能形成良好单层，单位面积收获的细胞数量在细胞工厂和转瓶内培养的结果基本一致,CORNAG细胞工厂培养的5批结果平均为18.91（?个/bn',NUNC细胞工厂培养的5批结果平均为19.9810

8、个ybnlSL转瓶内培养的S批结果平均为19.8210个/Cm：,相互间无差异（0-05）,见表1他传代按410个接种到细胞工厂和15L转瓶内培养时,4d均能形成良好单层，以单位面积的收获细胞数量做比较，细胞工厂和转瓶培养的结果也基本一致，CORNT4G细胞工厂培养的P1的细胞收获数量为16.8410：个处的细胞收获数量为16.M10个如气NUNC细胞工厂培养的P1的细胞收获数量为17.310个知：的细胞收获数量为17.7810*个/an：,15L转瓶培养的Pl的细胞收获数量为17.310个勺细胞收获数量为】7610个/tin：,细胞工厂与转瓶之间无差异（0.05,见表1。表1牛肾细胞在细胞工

9、厂上的增殖结果TatxlTiiereultofiiearavtioffiieSidneycdiinCeiSTACKVcsaBatiiP°Tuenirabe-ofnarvestcdt(1O'/cmrR)RCeiSTACKl2010050418.7016.H)16.80(CORNFJG>2010060119.2016.2017.202010060718.9017.SO16.5D2010080118.6016.8017.002010080219.1017.2016.90Aveaae18.9016J416.88CeiSTACK2010050419-5)16.8017.20(NU

10、NC)2010060120.2017.5017.802010060721.317.0018.502010080120.4017.4017.602010080218.3017J017.80Ao-aae19.9317.3017.78Roiitrt»tie2010050420.5)17.6017.802010060119.3016.9017.202010060720.9017.0017.602010080119.6017.2018.202010080218_8O18.2017.20Atraae19.8217.3017.602轮状病毒原液的滴度结果5批轮状病毒原液的滴度结果（表2）表明，牛肾

11、细胞传代2次后接种轮状病毒，细胞工厂和转瓶内培养的轮状病毒原液的滴度基本相同，CORN1NG细胞工厂培养的5批轮状病毒原液的滴度平均为5.73LaCCD/LUNC细胞工厂培养的5批轮状病毒原液的滴度平均为5_83LaCC©,/iL,15L转瓶内培养的5批轮状病毒原液的滴度平均为5_87LaCC/iL,由此可见三者之间无显著性差异（0-05。表2轮状病毒原液滴度结果Ta1x2TiiettcrfifbneofrotvirusvaccineVesdTits-AveaaeDi-ftreice201005)420100601201006072010080120100802CeiSTACK5.H

12、)5.805.3)6.255.605.73(CORNtlG)CoiSTACK5.755.506.255.676.005.830.10(NUNC)Roffebitfe5.506.255.756.005.835.870.140.043使用的培养空间与培养液的比较根据细胞工厂和15L转瓶提供的培养内表面积10个40层的细胞工厂提供的细胞生长面积相当于90个15L转瓶提供的细胞生长面积，将10个40层的细胞工厂放置于孵房培养时，占地空间仅为0.5m3,而90个15L转瓶的占地空间为4.5m气两者相差4.0m',细胞工厂比15L转瓶节省88.9%的空间;10个40层细胞工厂培养细胞时所需的营养液

13、为72000inL,而90个转瓶培养细胞时所需的营养液为148500mL,两者相差765D0mL,在收获相同数量细胞的情况下，细胞工厂比15L转瓶节省9的营养液，见表3表3培养空间与培养液的比较Tab.3TliecomparisonoftieproductionspaceandcuilaremedimCuitireareiFloorarcsSpaceCiiitiiremcdiaVgsaNurr.ktr(cn3)(m?)(m3)(mL)CetiSTACK10254000.70.572000Roiiet>tie90250002.54.5148500Dileence-1J-4.0-76500S

14、averaid%)7288.93.5讨论转瓶是目前国内用于细胞培养"疫苗的主要容器，要使细胞在转瓶内尽快均匀贴壁并分裂增殖,须放置在转瓶机上进行旋转培养,转瓶机占用空间较多，劳动强度较大，转瓶机的故障均会影响细胞培养的质量，从而影响疫苗的产量和质量，还由于受培养空间的限制，制约着产量的进一步扩大蜘工厂是一种新型的细胞培养容器，材质为符合贬国药典瓷定的聚苯乙烯，采用静止培养方式，培养表面经特殊处理，大大提高了细胞的吸附性O由于细胞工厂培养面积相对较大，可以节约操作时间和培养厂房空间S细胞在培养时存在密度依赖，牛肾细胞在接种密度过低时，在培养过程中不易形成良好单层，接种密度过高时，又会出

15、现密度抑制，不利于牛肾细胞的有效分裂淄过试验以及参照转瓶培养时的接才密度，用细胞工厂培养牛肾细胞时，原代牛肾细胞按2010*个知'，传代牛肾细胞按4I0'个/tnr的接种密度进行接种比较适宜，在规定的时间内牛肾细胞能形成良好单层，符合口服轮状病毒活疫苗生产的工艺要求代牛肾细胞接种轮状病毒后，经IB工厂培养制备的疫苗原液的滴度与转瓶培养之间无显著差异2346文献资料显示，国内外已有分别用细胞工厂培养传代细胞生产甲肝疫菌*和培养沙鼠肾原代细咆制备宵综合症出血热灭活疫苗的报道国未见有细胞工厂培养牛肾细胞制备轮状病毒疫苗的报道，基于改进生产工艺的目的，本文作者对这种方法进行了探索季验结

16、果表明，用细胞工厂生正I服轮状病毒活疫苗是可行的，与转瓶生产相比，能节省50%的营养液和80%以上的培养空间，也具有减少瓶间差异，提高疫苗质量的均一性等优点，可以进一步扩大产能，满足市场需求O参考文献:1鱼轲.魏至栋，庞兴.等-不同代次牛骨原代细胞培养轮状荆毒的比较研究UJ-微生物学免疫学进展,2007,35(4)：2-姚伟，伸建琴，苏波，等.细胞工厂培养沙鼠肾原代细胞制备肾综合症出血热灭活疫苗中国生物制品学杂志.2010.23(6):613-614.刘学平，沈劲草，蔑至栋.等-牛肾原代细胞培养最透接种浓度的选择叫-甘市科技，。的.19:62-63.刘学平，魏至栋，沈劲草，等牛肾组织及其培弄物

17、的不同消化法效果评价-微生物学免疫学进展.2010.3(I):30-31.HaaetiAJ.Ali>ud1A.Dquiitip$PA.etaf.UseofimcieiseeineintiepuriNationofrAQTAauq)atitsAVaccineJ-BiotecuroiAppiBiodiem.I996,23:209-215.兰蓉，周珍辉-细胞培养技术M-北京：化学工业出版社，2007:17-13.牛.物学免疫学进展*2年征订启事VHs物学免疫学进展。I：哗人民共和国卫生部主管预防医学会和兰州生物制品研究所共I毗如勺中华预防医学会系列杂志之一，系一国学术期刊综合评价数据库I源期刊。中国核心期刊(渤数据库VA期刊中国生物学文摘VX国生物学文献数据库VA期刊，国内外公开发行73年创刊,主要刊登国内外医学里物学疫学物化学传工程行病学等方面的