基因载体选择和构建质粒

1、基因载体选择和构建质粒 离开染色体的外源DNA不能复制，而插入的外源DNA可作为复制子的一部分在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。 载体（vector）是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是DNA复制子。是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分。载体的简介一、基因载体的概念1. 分类 按来源分质粒载体噬菌体载体病毒载体 按用途分克隆载体：克隆一个基因或DNA片段表达载体：用于一个基因的蛋白表达整合载体：把一个基因插入到染色体基因组中 按性质分温度敏感型载体融合型表达载体非融合型表达载体2. 载体应具备的特性 能在宿主细胞内进行独立和稳定的DN

2、A自我复制，插入外源基因后，仍保持稳定的复制状态； 易于从宿主细胞中分离，并进行纯化； 载体DNA序列中有单一的酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内； 具有能够观察的表型特征，如报告基因（遗传标记），插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。二、载体的报告基因（选择标记基因） 报告基因： 有特殊意义的基因，重组子转入宿主细胞中，可一句报告基因从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。2. 常用的报告基因： 抗药性基因，氯霉素乙酰转移酶基因，lac Z基因，人生长激素基因等。 抗药性基因： 四环素抗性、氨苄青霉素抗性 链霉素抗性、卡那霉素抗性 三、载体的致死效应 利用载体进行克隆时，有时可

3、能对大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能有害，宿主细胞呈现致死效应。如大量表达目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。第一节 质粒载体一、质粒的生物学特性（一） 质粒的简介 质粒（plasmid）是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，可自身复制和表达。 结构比病毒简单，无蛋白质外壳，无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内独立地增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。 常见的构型A. 共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，呈现超螺旋的SC构型(supercoil)。B. 开环DNA(ocDNA):两条链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC

4、型。C. 线性DNA(lDNA):经过适当的核酸内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子，即L型。（二） 质粒DNA的分子特性LOCSC质粒DNADNA促旋酶ATP负超螺旋拓扑异构酶 能自我复制：是独立的复制子； 对宿主生存不是必需的； 都有一个复制起始区和复制起点（ori）； 有一套完整的复制调节结构； 分子小，分子量仅为细菌染色体的0.01 2%； 具有转座子。根据寄主细胞所含的拷贝数多少将质粒分为：拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目。严紧型：低拷贝数的每个细胞可达12个拷贝，宿主蛋白合成停止后，质粒DNA复制停止。松弛型：高拷贝数，每个细胞可达100200个拷贝，宿主

5、蛋白合成停止后，质粒DNA复制仍继续。 通常选用松弛型质粒作为载体，以获高产的目的基因。（三）质粒的复制类型 同一种质粒，在不同寄主中表现为不同的复制类型例，R1质粒和Col E1-K30质粒R1质粒Col E1-K30E.Coli中严紧型松弛型奇异变形杆菌中松弛型严紧型 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。也称为质粒的不亲和性。 质粒的不亲和性是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。（四） 质粒的不亲和性 如Col质粒的派生质粒ColE1、ColE2和ColE3（不亲和群）三种质粒在同一寄主细胞中，不能含有其中的任

6、两种。 在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥掉，这样的两种质粒，称为不亲和质粒。 1. F质粒 又叫F因子(fertility factor)、性质粒或致育质粒。是最具代表性的单拷贝的接合型质粒，共编码着19个转移基因。特点：能使寄住染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒受体细胞中去。（五）质粒的种类 产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。2. R质粒3. Col质粒 又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。 2. 质粒类型接合型：又叫自我转移的质粒，带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 非接合型：不能自我转移的质粒，无控制细胞配对和接合转移

7、的基因。 （非结合型更适合基因工程安全）（六）质粒的转移性1. 概念：质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。接合型质粒：分子量大、有编码控制DNA转移的基因能自我转移。非接合型质粒：分子量小，无编码控制DNA转移的基因不能自我转移 寄主中同时存在非接合型和接合型质粒时，非接合型也可以被转移。非接合型质粒大肠杆菌素Col质粒：有大肠杆菌素基因大肠杆菌R质粒(R因子):有抗菌素抗性基因接合型质粒F因子带有大肠杆菌素基因的F因子Col质粒带有抗菌素抗性基因的F因子R质粒A. 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段 F+ 细胞；B. 以染色体外

8、环形双链质粒DNA形式存在，同时携带着寄主染色体基因或DNA区段 F 细胞； 3. F因子的接合作用 F因子，是雄性决定因子，F+细胞叫雄性细胞，F-细胞则称为雌性细胞。 F+细胞表面可以形成一种叫做性须的结构，促进雌性细胞同雄性细胞进行配对。 F因子特性 接合作用： 合适条件下， F+ 细胞和F- 细胞混合培养，由于性须的作用，形成-细胞配对的过程。 配对期间， 细胞中的F因子按滚环复制模式经性须作用进入到细胞，配对后F- 细胞获得了F 因子，也变成F+ 细胞。 滚环复制： 用于双链环状分子复制单链环状分子。 雄性细胞有23条性须，在受体细胞的识别以及在确定配对细胞之间的表面接触方面，起到重

9、要的作用。 一旦雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速地收缩，把供体细胞与受体细胞拉在一起。 雄性细胞具有只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。接合作用滚环复制例 Col E1质粒 其中参与迁移的有两种基因bom 基因：位于Col E1DNA上的特异位点；mob 基因：Col E1质粒特有的，其编码的核酸酶作用 于bom位点；4. Col E1质粒的迁移作用质粒的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移的过程。 具有较小的分子量和较高的拷贝数：可容纳外源DNA更长； 改造内切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）； 具有2种以上的选择标记基

10、因； 无mob基因； 插入外源基因后，较易导入宿主菌内复制和表达，且不会因接触而转移到另一个细菌。二、质粒载体的必备条件polylinker作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制子、选择性记号、克隆位点多克隆位点：是指载体上人工合成的含有紧密排列的限制性内切酶酶切位点的DNA片段。 1、 天然质粒； 2、 pBR322质粒载体； 3、 pUC质粒载体； 4、 pGEM系列质粒； 5. 穿梭质粒；三、常用的质粒载体 1.1.天然质粒天然质粒 概念：没有经过以基因克隆为目标的体外修概念：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天在大肠杆菌

11、中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有然质粒有Col E1、RSF2124和和pSC101等，但存在等，但存在一定的局限性。一定的局限性。 第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它，它只含有一个只含有一个EcoR酶切位点，一个四环素抗酶切位点，一个四环素抗性选择记号（性选择记号（Tetr ）,插入外源片断后不影响插入外源片断后不影响其复制功能。其复制功能。 但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。择重组分子。 pSC101 ColE 1ColE 1质

12、粒在其唯一的单切割位点质粒在其唯一的单切割位点EcoREcoR中克中克隆外源隆外源DNADNA片断后，可根据对大肠杆菌素片断后，可根据对大肠杆菌素E1E1的的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素素E1E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。 ColE 1 RSF 2124 根据对氨苄青霉素的抗性表型选择转化子。 Col ECol E1 1质粒载体质粒载体 松弛型、多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素松弛型、多拷贝的质粒，能产生细菌素。细

13、菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译及能量代谢等），但含有对细菌素的转录、转译及能量代谢等），但含有对细菌素的免疫基因。免疫基因。 细菌素：是一类特殊的蛋白质。通过同敏感细菌细细菌素：是一类特殊的蛋白质。通过同敏感细菌细胞壁的结合作用，而抑制一种或数种在细胞内进行胞壁的结合作用，而抑制一种或数种在细胞内进行的生命过程。的生命过程。 大肠杆菌素有多种类型，如B、E1、K、E2、E3，其抑制敏感细胞的作用方式不同。大肠杆菌素对于不带有相应Col质粒的敏感细胞有致死作用，而带有Col质粒的细胞对于基因所编码产生的大肠杆菌素是免疫的。对免疫

14、性标记的检测方法： 将产生大肠杆菌素E1的寄主细胞涂布在有敏感细菌长成的菌苔上，寄主细胞分泌出的大肠杆菌素E1会抑制周围敏感细胞的生长并使之致死菌苔背景上出现空斑的清亮区 在EcoR位点上插入外源DNA，会使该基因失活，但其免疫性仍存在。免疫基因immE1可以作为质粒的选择记号。 用用 ColE ColE 1 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性：存在一定的缺陷性： 应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便；应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便； 在细菌群体中，能够以相当高的频率自在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。发的

15、产生出抗菌素的突变体细胞。2.pBR3222.pBR322质粒载体质粒载体 “P P”表示是一种质粒；表示是一种质粒； “BRBR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母表示两位主要构建者姓氏的头一个字母 “F.BilivarF.Bilivar和和”; ; “322322”表示实验编号。表示实验编号。 具有多抗药性的强选择记号、低分子量、高具有多抗药性的强选择记号、低分子量、高拷贝、外源基因插入后不影响该质粒复制功能拷贝、外源基因插入后不影响该质粒复制功能的多种核酸内切限制酶单切割位点等特点。的多种核酸内切限制酶单切割位点等特点。 pBR322主要组成部分的来源 亲本：pMB1和pSF2124;

16、Ampr基因来源于pSF2124； Tetr基因来源于Psc101; 复制起点（ori）来源于Col E1。Example: 在在pBR322pBR322质粒的质粒的BamHBamH或或SalSal位点插入外源位点插入外源DNADNA片断，片断，切断了切断了tettetr r基因编码序列的连续基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出性，使之失去活性，产生出AmpAmpr rTetTets s表型的重组表型的重组pBR322pBR322质质粒，转化入粒，转化入AmpAmps sTetTets s的大肠杆的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具素的选

17、择培养基上，筛选出具AmpAmpr r菌落，再将它们涂布于含菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。这种培养基上生长。ampr pBR322 pBR322质粒载体的优点质粒载体的优点 A. A. 具有较小的分子量具有较小的分子量 它的分子量为它的分子量为4363bp4363bp。克隆载体的分子量大小。克隆载体的分子量大小不要超过不要超过10kb10kb。 B. B. 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号号 C. C. 具有较高的拷贝数，而且经

18、过氯霉素扩增之具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累后每个细胞中可积累1000-30001000-3000个拷贝。个拷贝。 pBR322 pBR322质粒载体的改良质粒载体的改良 为了更加实用，人们对为了更加实用，人们对pBR322pBR322质粒进行了改良，得到许多质粒进行了改良，得到许多pBR322pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。 载体的要求：使载体内易位子失去易位能力；载体的要求：使载体内易位子失去易位能力； 载体不具有接合转移的能力。载体不具有接合转移的能力。 pBR322pBR322基因组的基因组的mobmob

19、基因缺失，所以不能被可转移的质粒所基因缺失，所以不能被可转移的质粒所迁移迁移安全载体。安全载体。 改良：使改良：使bombom位点缺失。位点缺失。3. pUC3. pUC质粒载体质粒载体 人们应用多克隆位点技术，在人们应用多克隆位点技术，在pBR322pBR322的基的基础上，组入了一个在其础上，组入了一个在其5 5- -端带有一段多克端带有一段多克隆位点的隆位点的lacZlacZ基因，而发展的具有双功能检基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。测特性的新型质粒载体系列。 pUC质粒的结构来自pBR322质粒的复制起点（ori）；氨苄青霉素抗性基因（Ampr ）,但序列发生变化，无

20、原来的核酸内切限制酶识别位点；大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因；位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点区段(MCS),但它并不破坏该基因的功能。AmproriMCS (Multiple cloning sites,多克隆位点）Lac promoterlacZpUC18(3 kb) pUC pUC质粒载体的优点质粒载体的优点第一，第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数具有较小的分子量和更高的拷贝数; ; 仅保留了仅保留了pBR322pBR322的的Ampr和和oriori；平均每个细胞；平均每个细胞 500500700700个拷贝。个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；第二，适用于组织化学检测重组体； 具有来自大肠杆菌具有来自大肠杆菌laclac操纵子的操纵子的lacZlacZ基因，所编码的基因，所编码