分子生物学与基因工程主要知识点

1、分子生物学与基因工程复习重点第一讲绪论1、 分子生物学与基因工程的含义从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。2、 分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型；60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型；70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组D

2、NA分子；80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术；90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”；目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支撑作用第二讲核酸概述1、核酸的化学组成（图画说明）2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别（1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖；（2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完

3、全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据；间接：（1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA在代谢上较稳定。（3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体

4、有其自己的DNA。（5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100ºC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在 260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为

5、两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。5、Tm的含义与影响因素Tm的含义：是指吸收值增加的中点。影响因素：1） DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2） 溶液的离子强度3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大4）某些化学物质（5）溶液pH值6、DNA的一级结构的含义与特点，包括化学本质7、DNA双螺旋模型的发现过程、基本内容与生物学意义（1）两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上；（2）两条多

6、核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为53方向，而另一条为3一5方向，二者刚好相反；（3）每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键与它互补的碱基相联系。互补碱基对A与T之间形成两对氢键，而C与G之间形成三对氢键。上下碱基对之间的距离为0.34nm；（4）每个螺旋为3.4nm长，刚好含有10个碱基对，其直径约为2nm；（5）在双螺旋分子的表面大沟和小沟交替出现。生物学意义：双螺旋模型的意义，不仅意味着探明了DNA分子的结构，更重要的是它还提示了DNA的复制机制：由于腺膘呤(A)总是与胸腺嘧啶(T)配对、鸟膘呤(G)总是与胞嘧啶(C)配对，这说明两条链的碱

7、基顺序是彼此互补的，只要确定了其中一条链的碱基顺序，另一条链的碱基顺序也就确定了。因此，只需以其中的一条链为模版，即可合成复制出另一条链。第一次提出了遗传信息的贮存方式以及DNA的复制机理,揭开了生物学研究的序幕,为分子遗传学的研究奠定了基础。3、 DNA精细结构的含义与重要参数（1）依赖于序列的B-DNA构象变化；（2）连续AT序列的构象；（3）含错配碱基对的B-DNA；（4）DNA的局部构象与DNA结合蛋白4、 DNA超螺旋结构的形成与鉴定超螺旋DNA可采取两种拓扑学上相当的形式。一种相当于双螺旋绕圆柱体旋转；另一种相当于双螺旋相互盘绕。超螺旋的这两种形式可以相互转变。天然的DNA都呈负超

8、螺旋，但在体外可得正超螺旋5、 DNA不寻常结构有哪些，有何作用？交替的嘧啶、嘌呤重复序列倾向形成Z-DNA反向重复序列倾向形成十字形结构构成镜像重复的同型嘧啶-同型嘌呤序列可能形成三链结构：在形成三链DNA过程中游离出来的多聚嘌呤链则保持单链状态。故三链DNA对S1核酸酶的作用敏感。由于三链DNA含有镜像重复，故可形成两种异构体：一是多聚嘌呤链的5部分成单链；另一是3部分成单链。富含G的序列可能形成四链结构：端粒DNA的序列具有一定的取向特征。在每一染色体末端，富含G的一股链由5向3-末端延伸，并突出于互补的富含C一股链1216核苷酸（下图）。染色体的末端与特定的蛋白质形成复合物。第三讲染色

9、体与基因组的结构1、 真核生物染色体的结构，包括基本单元的化学组成染色体是由染色质（chromatin）构成的，染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。染色体是动态的物体，其外观随细胞周期的不同阶段发生明显的改变。仅当细胞分裂时，每个染色体才呈现出凝聚型。（1） 组蛋白：组蛋白在翻译后是受到修饰的，其中包括特异精、组、赖、丝和苏氨酸残基的甲基化、乙酰基化和磷酸化（2） 核小体（3） 30 nm 纤丝（4） 辐射的环2、 真核生物基因组的C值与特点在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为C值。（名词解释）特点：3、 基因组中DNA的大小、形状与序列组织：包括卫星DN

10、A和微卫星DNA的含义DNA一般为长而无分支的双股线性分子，但有些为环型，也有少数为单股环型。不同的 DNA大小相差悬殊。例如，SV40含 5.1 kb，而南美肺鱼的基因组含102 000 000 kb。虽然一般而言，复杂的有机体需要更多的DNA，但不存在严格的对应关系。真核生物DNA碱基组成上的异质性主要由于存在着以下3类DNA序列：高度重复序列；中度重复序列；单一序列。卫星：有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度与主体DNA不同，在氯化铯密度梯度离心时，可形成相对独立于主DNA带的卫星带。这些卫星带称为卫星DNA。微卫星DNA：微卫星DNA是由更简单的重复单位组成的小序列，分散于基因组

11、中，大多数重复单位是二核苷酸，也有少量三或四核苷酸的重复单位。4、 真核生物的基因组特点（与原核生物比较）真核生物基因组与原核生物的相比，主要有以下几方面的差异（特点）：（1）分布部位（2）基因特性（3）遗传信息的传递过程（4）自身的复制过程第四讲蛋白质的结构与功能1、蛋白质的含义蛋白质一词最早来自希腊语“proteios”，其含义为“第一重要的”。现代科学研究表明，蛋白质是由20种左右的a-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学功能的高分子有机化合物。1、二十种氨基酸的英文简称，要求掌握一个字母的含义1、蛋白质一级结构的含义它是指蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，也是蛋

12、白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序，通过肽键连接起来，成为多肽链，故肽键是蛋白质结构中的主键。2、蛋白质二级结构的类型，包括阿尔法结构与DNA双螺旋的异同点-螺旋、-折迭、-转角、无规则卷曲（填空题）（1）多个肽键平面通过-碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋；（2）主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm，这与X衍射图符合；（3）相邻两圈螺旋之间借肽键中CO和硫氢基形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的CO之间形成氢键，这是稳定-螺旋的主要键；（4）肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧，其

13、形状、大小及电荷影响-螺旋的形成。酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于-螺旋形成；较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域，也妨碍-螺旋形成；脯氨酸因其-碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述-螺旋；甘氨酸的R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。1、蛋白质结构与功能的关系（1）蛋白质一级结构与功能的关系：蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，在生物体内，蛋白质的多肽链一旦被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。（2）蛋白质空间构象与

14、功能活性的关系：蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。血红蛋白是红细胞中所含有的一种结合蛋白质，它的蛋白质部分称为珠蛋白，非蛋白质部分(辅基)称为血红素（x）第五讲DNA复制1、一些基本概念：复制子、复制单元、复制起始点、半保留复制、半不连续复制、前导链、随后链、冈崎片段。 DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂使两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条

15、链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。：亲代双链DNA以每条链为模板，按碱基配对原则各合成一条互补链，这样一条亲代DNA双螺旋，形成两条完全相同的子代DNA螺旋，子代DNA分子中都有一条合成的“新”链和一条来自亲代的旧链，称为半保留复制。连续合成的链比不连续合成的链超前一步，称为前导链。2、不连续合成的链要滞后一步，称为后随链。前导链连续复制和后随链的不连续复制，称为DNA的半不连续复制。随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做冈崎片段。复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点。生物体的单个复制单位称

16、为复制子。1、 要求掌握DNA定点双向复制（画图说明）4、单链结合蛋白的作用它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。5、 DNA复制的酶学基础及原核生物复制的一般过程，包括DNA复制前导链和随后链的起始、延长和终止（包括图解说明）6、真核生物DNA复制的特点（与原核生物比较）（1）与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点（2）在真核生物DNA复制叉处，需要两种不同的酶。（3）由于真核生物染色体是线性DNA，它的两端叫做端区，端区是由重复的寡核苷酸序列构成的。（4）真核生物具有多重复制

17、原点，原核生物只有一个。第六讲RNA生物合成及其加工1、一些基本概念：不对称转录、编码链（信息链）、模板链、启动子、转录因子在DNA的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板，这条链叫做模板链，又叫反义链。DNA双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫有意义链。编码链的的序列与转录本RNA的序列相同，只是在编码链上的T在转录本RNA为U，由于RNA的转录合成是以DNA的一条链为模板而进行的，所以这种转录方式又叫做不对称转录。启动子：指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成转录起始复合物的区域，还包括一些调节蛋白因子的结合序列。转录因子：凡是转录起始过程必需的蛋白质，只要不是RNA聚合酶的组成成

18、分，就可以将其定义为转录因子。2、RNA生物合成的酶学基础：包括该酶的组成与特点3、原核生物DNA转录的基本过程，包括启动子的识别、起始、延长和终止4、真核生物转录与原核生物的区别5、原核生物转录与复制的主要区别6、mRNA加工基本过程：要求掌握帽子与尾巴结构的名称与作用及形成过程· 5¢端形成帽子结构(m7GpppNp )· 3¢端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)· 中部剪接除去内含子· 链内部核苷酸的甲基化mRNA帽子的生理功能：帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。帽子结构

19、增加mRNA的稳定性，保护mRNA防止其受5核酸外切酶的降解。促进某些RNA的合成。尾巴：7、tRNA加工基本过程：要求掌握氨基酸臂名称、加工酶系及碱基修饰方式剪切内含子核酸外切酶修剪3´末端，逐个切去附加序列；加上CCA-OH的3´末端，完成柄部结构。碱基修饰第七讲蛋白质生物合成1、蛋白质合成的物质基础包括哪些方面（1）合成原料（2）mRNA是合成蛋白质的直接模板（3）tRNA是氨基酸的运载工具（4）核糖体-蛋白质的合成场所（5）蛋白质生物合成的必需因子2、遗传密码的特点及解析（1）起始码：绝大多数生物的起始密码子都是AUG，作为多肽链合成的起始信号，同时编码一种氨基酸，

20、原核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲酰甲硫氨酸，真核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲硫氨酸。（2）终止码：密码子UAA、UAG、UGA并不编码任何氨基酸，起着终止肽链合成的作用，因此成为终止密码子。（3）密码无标点符号（4）密码的简并性：简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，（5）密码的通用性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。但已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。3、核糖体作为蛋白质或多肽装配机器的原因核糖体作为蛋白质的合成场所，它提供了模板mRNA的结合位点、肽酰基tRNA位、氨基酰tRN

21、A位、转肽酶活性部位及蛋白质合成起始因子IF、延长因子EF和终止因子RF的结合部位。4、原核生物蛋白质合成的基本过程，包括氨基酸的活化、合成的起始、多肽链的延长与释放。5、多核糖体循环的含义事实上在细胞内一条mRNA链上结合着多个核糖体，甚至可多到几百个。蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结合，引入第一个蛋氨酸，然后核糖体向mRNA的3端移动一定距离后，第二个核糖体又在mRNA的起始部位结合，向前移动一定的距离后，在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。两个核糖体之间有一定的长度间隔，每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成

22、多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率。第八讲基因表达调控1、一些基本概念：基因表达、基因表达组织特异性、基因表达阶段特异性、组成性表达、适应性表达、顺式作用元件、反式作用元件（1）基因表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。（2）基因表达组织特异性：遗传信息的表达是受到严格调控的，通常各组织细胞只合成其自身结构和功能所需要的蛋白质。不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同，这就是基因表达的组织特异性。（3）基因表达阶段特异性：细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的，这就是基因表达的阶段特异性。（4）组成性表达：指不大

23、受环境变动而变化的一类基因表达。（5）适应性表达：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。（6）顺式作用元件：指DNA上对基因表达有调节活性的某些特定的调节序列，其活性仅影响与其自身处于同一分子的基因。（7）反式作用元件：调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物-调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用，调控基因就属于反式作用元件。2、乳糖操纵系统的组成部分及作用乳糖操纵元含有z、y和a三个结构基因。z基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、

24、分子量为135kD的多肽，以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖，再分解为半乳糖和葡萄糖；y基因长780bp，编码由260个氨基酸组成、分子量30kD的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；a基因长825bp，编码含275氨基酸、分子量为32kD的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。3、 乳糖操纵子模型的基本内容及在分子生物学中的地位操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元。在分子生物学中的地位：重要的里程碑4、 真核生物基因表达调控的特点（与原核生物比较）（1）真核基因表达调控的环节更多（2）真核基

25、因的转录与染色质的结构变化相关（3）真核基因表达以正性调控为主第九讲基因操作工具酶1、一些基本概念：工具酶、粘性末端、平末端、同位酶、同尾酶、同裂酶、酶活力单位（1）工具酶：在DNA分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶（2）黏性末端：大多数限制性核酸内切酶并不是在DNA两条链的同一个位置切断，而是在两条链错开24个核苷酸切断，这样产生的DNA末端会带有5突出或是3突出的DNA单链，这种末端称为黏性末端。（3）平末端：有些限制性核酸内切酶能够在识别序列中间的同一个位置将DNA双链切断，产生的DNA末端是平末

26、端。（4）同位酶：识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。（5）同尾酶:许多不同的限制性核酸内切酶识别序列虽然不完全相同，但切割DNA产生的末端是相同的，这些酶统称为同尾酶。（6）同裂酶：具有相同识别序列的限制性核酸内切酶称为同裂酶。（7）酶活力单位：在适当的反应条件下(包括温度、pH和离子强度等),1h内在50l容积中完全酶解1g特定DNA底物(通常用DNA)所需要的酶量。2、基因操作工具酶的分类与举例说明（1）限制性内切酶：根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶I型和III型酶在同一蛋白酶

27、分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大II型酶切割DNA片断活性和甲基化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用通常所用的限制性内切核酸酶是指II型的（2） DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I；Klenow DNA 聚合酶；T4 DNA 聚合酶；T7噬菌体DNA聚合酶；耐热DNA聚合酶；逆转录酶（3） DNA连接酶T4 DNA连接酶；大肠杆菌DNA连接酶：T4 RNA连接酶3、限制性内切酶的含义、分类、命名、特点与影响因素含义：是一类能够识别双链DNA分子中某些特定的核苷酸序列，并在该序列切割DNA双链的核酸内切酶。分类

28、：按水解断裂分子的方式不同，核酸酶可分为2种类型：一类是从核酸分子的末端开始逐个消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段，叫做核酸内切酶。科学家们根据酶分子结构和功能特性的差异，又把限制性核酸内切酶分为3种类型：I型酶、II型酶、III型酶。命名：采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名用来源细菌的英文缩写斜体符号命名；它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母；第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。特点：专一性: 一种限制酶只能识别一

29、种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子多样性: 限制酶有200多种影响因素：星活性DNA样品的纯度DNA的甲基化程度DNA的分子结构侧翼序列长度4、DNA连接酶的含义、种类及作用机理含义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。种类：T4 DNA连接酶；大肠杆菌DNA连接酶：T4 RNA连接酶作用机理：连接酶的作用：在双链DNA中，DNA连接酶能催化具有邻近3-羟基和5-磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体DNA片段连接，使之成为一个完整的重组DNA分子。连接的部位：磷酸二酯

30、键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。结果：黏性末端（包括平末端）连接起来。第十讲基因操作载体1、载体的含义与特点含义：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA分子。载体特点：（1）能在宿主细胞中复制并稳定地保存-具复制原点。:在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能与携带的外源DNA一起复制（2）能与目的基因连接-具多个限制酶切点，而每一个这样的酶切位点在载体DNA中只有一个（广泛、特异）（3）便于筛选鉴定-具有标记基因，这种选择标记基因通常是抗抗菌素基因或某种酶基因，而宿主细胞并不具有（4）操作简单-分

31、子量小,高拷贝数，转化效率高,容易从宿主细胞中分离纯化2、载体的主要类型细菌质粒载体（10kb) 包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体噬菌体衍生载体(9-23kb)柯斯质粒(Cosmid)载体(40-50kb)一种由质粒和噬菌体cos尾巴构建复合载体 M13载体一类专门用于Sanger法测序的载体 Phagemid载体一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体3、质粒载体的特点与作用（图解分析）4、蓝白斑筛选的基本原理pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的序列（-互补肽）的DNA序列（标记为lacZ），多克隆位点就存在于lacZ上。-半乳糖苷酶的C

32、端编码基因却位于相应的宿主菌上。当这两个部分基因产物（缺陷型b-半乳糖苷酶）结合才会形成一个有活性的-半乳糖苷酶。这种机制称为-互补作用。定义：含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。5、基因表达载体与克隆载体的区别克隆载体是在克隆过程中用到的各种质粒，比如为了扩增目的基因的高拷贝质粒、为了方便测序的测序质粒、为了连接PCR产物的TA质粒、为了重组的穿梭质粒等等。克隆载体一般有较强的复制能力，利于基因的保存和扩增，

33、而且提供丰富的酶切位点等等。它不必有强启动子，因为不重于表达。表达载体是基因克隆结束后，为了在特定细胞内表达而构建的。他重点在于表达，有各种各样的启动子适应于不同种类的细胞，并且有各种各样，如诱导等可控的表达调控方式。6、真核生物载体（pEGFP-N1载体）的类型与特点从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；具有多克隆位点，便于目的基因的插入；该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。第十一讲基因

34、操作常用技术1、分子杂交技术的分类及基本原理原理：核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基配对原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针和待测核酸。2、PCR技术的基本原理（包括反应体系和反应进程）PCR 反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系组成。94预变性 510min，94变性30s2min，退火 30s2min，72延伸15min72延伸510min，中间三步循环，具体时间依自己的模板和引物情况而定。3、PCR的主要类型及应用（1）反转录PCR（RT-PCR）反转录PCR即以

35、mRNA作为模板，进行反转录合成cDNA的PCR方法其样品模板为mRNA。一般分两步进行：第一步用反转录酶将RNA反转录成cDNA，第二步以cDNA为模板进行PCR扩增目前已发现一种rTth酶，既有反转录酶活性又有DNA聚合酶活性。因此做RT-PCR可简单到用一种酶和一种缓冲体系在一个反应管内直接扩增RNA（2）巢式PCR巢式PCR是指用两对引物先后扩增同一样品的方法。先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段DNA，再用一对内侧引物以大片段DNA为模板扩增目的基因优点：较常规PCR灵敏度大大提高，同时第二次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性用于临床检验（如血清中丙型肝炎的检测）（3）多重PCR在

36、反应中用多组引物同时扩增基本称复合PCR在同一反应中加入多对引物，以一个DNA分子为模板,同时扩增几种不同序列的PCR片段的方法用于同一病原体分型及同时检测多种病原体；多点突变性分子病的诊断（4）荧光定量PCR是用PCR方法对样品起始模板浓度进行定量分析的一种方法通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量用这一方法对组织细胞中的特定mRNA进行定量分析，从而了解某一基因的表达水平。（5）原位PCR利用PCR技术在细胞涂片或组织切片上直接对靶DNA片段进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法原位PCR与PCR相比，不需抽提组织细胞中的核酸，形态结构不被破坏；比原位杂交灵敏度一般可提高100倍。4、影响PCR的主要因素1、预变性 2、循环中的变性步骤 3、引物退火 4、引物延伸 5、循环数6、最后延伸5、两种DNA测序技术的基本原理与比较6、