活细胞提取和HPLC - MS分析预测中药生物活性成分

1、活细胞提取和HPLC - MS分析预测中药生物活性成分 李松林 一 ，李平， 一 ，良闳奢嗯 一 ，瑞燕丽 一 ，连闻柒 一 和陆雍喳嗯 一一 药科大学重点实验室中国近代中国药品，药学教育教育部中华人民共和国和系，南京210039，中国收到2005年9月3日; 修订了30件2005年12月 接受06年1月5日。 可在线2006年2月20号。 摘要一个新的战略，提出了在传统的生物活性成分，用于预测中药（中医）利用活细胞提取和高效液相色谱二极管阵列检测质谱法（HPLC - DAD的- MS）分析。 这个假设是，当细胞一起孵育减少中药提取物，成分中的潜在活性中医应该有选择的细胞结合，在悬架和细胞组分

2、的相对浓度相结合的培养基应，而细胞结合部分将提取物中检出变性细胞。 结合部分的细胞的身份，可确定的HPLC - DAD的质谱分析。 使用该方法，所用的中药活性成分的潜在当归补血，常用汤 贫血 ，它的成分，黄芪 当归 当归和黄芪的 内皮细胞 ，进行了调查。 六化合物的提取物汤当归补血检测元件的结合选择性 内皮细胞 ，其中两个是由药材贡献 当归 当归，黄芪及四个基数。 生物活性化合物的潜在身份的四个六分别鉴定为ononoside， 毛蕊异黄酮 ，三丁基苯酞和 藁本内酯 的HPLC - DAD的质谱分析。 结果表明，该方法可用于预测候选人中医药的生物活性。关键词： 活细胞萃取高效液相色谱法，二极管阵

3、列质谱;预测生物活性成分;当归补血汤，黄芪，黄芪 当归 当归文章概要1。 简介2。 实验2.1。 中药材和化学品 2.2。 样品制备 2.3。 细胞培养 2.4。 内皮细胞提取 2.5。 高效液相色谱分析3。 结果与讨论3.1。 生物活性当归补血汤候选人和血管内皮细胞中的成分为 3.2。 当归补血汤鉴定候选人的生物活性和血管内皮细胞的成分为4。 结论致谢参考文献1。 简介传统中药）中药（是中国传统的天然治疗的医疗理念的指导下使用的补救措施，并已订明中医界在中国及全球华人对几千年的历史。 中医主要是结合使用，其中复合公式将产生协同作用或拮抗作用 1 。 在大多数情况下，中药活性成分没有或只是部分

4、而闻名。 因此，筛选和分析中药成分的生物活性是非常重要的，不仅为阐明其治疗原则，而且为他们的质量控制。为寻找中药活性成分的提取与传统的程序是从中药成分精制在体外或体内药理筛选，纯化后的化合物。 虽然可能的化合物数量有限的中药药效负责，在生物活性化合物通常含有高达数百甚至不同的组件，这使得纯化和生物活性成分的筛选非常困难的数千复杂混合物。基于这一假设的活性成分应该会出现在 血液 和 尿液中 适当的 血 浓度，Homma等人尿排泄，利率后，中医药管理局。 介绍了生物活性成分的中药药代动力学的概念把他们的研究发现 2 。 这的确是一个概率的策略与可吸收生物活性更高的发现候选人。 但不保证可吸收生物活

5、性的化合物。 现代药理研究表明，药物作用的一个重要步骤，是具有约束力的一些受体和（或）通道（或）酶， 细胞膜 和（或）细胞内。 因此，有能力与细胞相互作用的药物是非常重要的活动是为生物。 基于这一原则，一些方法称为 细胞膜 色谱（CMC）的 3 和额亲和层析（刚果） 4 ， 其中，固定化细胞包埋膜受体或抗体作为液体色谱固定相，分别混合开发的在线或化学药物的研究和生物的迅速屏幕的候选人从复杂的分离和鉴定铅药物 3 ， 5 ， 6 ， 7 ， 8 和 9 。 最近，这些方法被聘用为有前途的方法从天然中药有效筛选的先导化合物或候选药物资源，包括 3 ， 5 ， 10 ， 11 和 12 。 然而，固

6、定化包埋生活受体或 细胞膜 等，很短（1天到1周） 3 ， 以及包封或固定程序必须适应该种材料要分析和所用种凝胶基质 13 。 此外，亲和组件的交互或生物膜中西医之间的兼容受体是很少的色谱分离。 此外，管委会不能直接连接到质谱在洗脱溶剂，因为目前存在的盐在高浓度的无机，中央军委以致于难以保留一个重要组成部分的网上身份与阐发。最近，董等人。 14 提出了一种新的方法使用中药活性成分的筛选和分析 细胞膜 萃取和高效液相色谱质谱法（HPLC - MS）分析，这是成功地应用于预测潜在的生物活性在多个化合物 当归 冬虫夏草 同时进行。 令人兴奋的结果表明，该方法具有优势，中医对常规方法进行调查潜在的生物

7、活性成分：这种方法首先，通过筛选，化合物感兴趣的数字相比减少将是极其中药，在复杂的混合物的原，这将使进一步调查更具成本效益;第二，高效液相色谱，质谱分析，不仅化合物的分离高分辨率，但也有兴趣的能力组件的身份鉴定的;第三，这种方法避免或固定程序的包封 细胞膜 ，其中专业，耗时而艰巨的工作。 又是如何的结果，如果裂解 细胞膜 是活细胞所替代，作为活细胞的情况下，都是该生物体细胞更多类似高于裂解 细胞膜 ，使细胞复合互动更加类似于在生物体，导致生物活性的概率很高的候选人。因此，在本研究中，提出了新的战略生物活性成分的筛选和分析中药使用活细胞提取和高效液相色谱二极管阵列检测质谱法（HPLC - DAD

8、的- MS）分析。 这个假设是，当细胞培养细胞连同中药提取物，化合物在生物活性的潜力中医应该有选择结合起来，悬浮介质的细胞结合成分的相对含量应减少，细胞成分结合将提取物中检出变性细胞。 结合部分的细胞的身份，可确定的HPLC - DAD的质谱分析。 使用该方法，处方药材的生物活性成分的当归补血汤，用结合了常用 当归 和黄芪当归（5:1，瓦特/瓦特）为 贫血 ，进行了调查。2。 实验2.1。 中药材及化学品黄芪 当归 当归和黄芪分别为采自中国岷县县和甘肃省，山西省浑源县，并验证李平教授。 阿魏酸 的产品获得了中国在控制研究所生物制药和（北京，中国）。 藁本内酯 和 毛蕊异黄酮 的分离纯化和黄芪

9、当归 当归和黄芪，分别在我们的实验室。 参考化合物的身份所有这些均经红外光谱，质谱， 1 H和 13 的C -核磁共振。 缓冲液A（pH值7.4）为5毫米 磷酸钠 缓冲。 甲醇 的LC是购自江苏科技Hanbon。 及技术。 有限公司（江苏，中国）。 去离子水制备微孔毫秒使用的Q - Plus系统（纯水，贝德福德，马）。 所有其他试剂均为分析纯。 所有溶剂和样品用0.45微米的过滤，然后用尼龙膜。2.2。 样品制备提取A ：30克黄芪混合粉末的：黄芪 当归 当归（5:1，瓦特/瓦特）浸泡在240毫升75乙醇回流1小时，并为1小时，然后在去除溶剂，旋转蒸发真空下40，残渣溶解在30毫升缓冲液A和膜

10、过滤通过0.22微米，滤液作为提取样品的HPLC - DAD的质谱分析和活细胞。提取B ：二十五克黄芪粉末被视为药材提取物A的程序为提取物C ：五克粉的药材 当归 当归被视为程序提取答2.3。 细胞培养人 脐静脉 内皮细胞的 收获，从 人 脐静脉 用0.05 胰蛋白酶 ，0.02 EDTA的 和镀了0.1，明胶涂层Dulbecco的改良Eagle的菜（流式细胞- Dickinson公司）在培养基（DMEM培养基）含20 胎牛血清 （ FBS的 ） 10微克L -1 碱性成纤维细胞生长因子 （ bFGF的 ），100区L -1 青霉素 （Sigma公司），100毫克升 -1 硫酸链霉素（Sigm

11、a公司）。 然后，5二氧化碳饱和湿度的细胞生长在一个 2 95的空气在37 C的分离与0.125 胰蛋白酶 - EDTA的 和）继代明胶涂层的聚酯片（250毫升，塑料供应商在播种密度为2.0 10 6 3.0 10 6 每张。 这些细胞进行培养，直到他们达到汇合（播种后2-3天），然后消化0.125 胰蛋白酶 。 离心后，在1000 克 2分钟，沉积悬浮细胞与细胞提取缓冲液A的生活。2.4。 内皮细胞 提取以上获得 内皮细胞 与1毫升混合提取物A分别置于37 C的6小时 受当时离心1000 克 5分钟，所得上清液质谱分析，用0.45微米过滤膜进行HPLC - DAD的-。 沉积的细胞洗涤毫升四

12、次2 PBS的 每个离心时间与随后在1000克 5分钟以去除可能非选择性地结合组成部分。 被丢弃的洗脱液除了最后一个是MS为对比分析收集到的高效液相色谱。 沉积的 内皮细胞 ，然后变性乙醇提取752毫升。 离心后，在1000 克 5分钟，上清液用0.45m的过滤膜进行HPLC - DAD的质谱分析。 该细胞含缓冲液A是一个缓冲区替换为空白对照样品准备使用上述程序相同。 通过比较样品与色谱提取收治了来自 内皮细胞 与对照样本，并分析物的峰面积有明显下降（或）检测提取物中细胞变性沉积被认为是潜在的候选人当归活性补血汤对 内皮细胞 。 同样的程序进行的提取物B和C，分别确定了当归补血汤峰有关的捐款。

13、2.5。 高效液相色谱法分析色谱分析，色谱仪在Agilent 1100系列液（安捷伦科技，帕洛阿尔托，加利福尼亚，美国），配备了双泵，一个这样的父亲探测器Rheodyne7125i喷射阀用20L样品回路，数据获取和处理惠普化学工作站。 采用Zorbax ODS C18色谱柱（4.6毫米 250毫米的ID，5m）和以ZORBAX ODS C18柱保护柱（4.6毫米 12.5毫米的ID，5m）的聘用，柱温为25 C时定 流动相：（一）0.5水溶液 醋酸 及（B） 甲醇 。 梯度洗脱条件为：0-10分钟，2040B级; 10-40分钟，40-65B级; 40-55分钟，B的65-85，流速为1毫升/

14、分钟，进样量为20L。 峰进行了监测，在254，280和320 nm处，分别为。高分辨率的质谱分析，在Agilent G1969的LC / MSD的TOF系统（安捷伦科技）源配有喷雾。 数据分析被收购和Ver的LC - MS飞行时间软件。 答：01.00（Agilent技术）和PE Sciex公司分析师qs的1.1。 的ESI源的操作条件为：毛细管温度300，毛细管电压3500伏;干燥气体（不适用 2 ）流，9升/分;雾化器（不适用 2 ）的压力，35督察。 全扫描数据进行采集，从 米 / 50到MS 3000扫描模式。3。 结果与讨论3.1。 生物活性当归补血汤的候选人，并组成其 内皮细胞当

15、归补血decocotion，发现中国历史上的东苑李靖远王朝的，是一个综合处方配伍黄芪 当归 当归（5:1，瓦特/瓦特），并已被用来治疗 贫血 的数千名中医在实践中年。 体外药理研究表明，结合本方提取物能抑制增强 内皮细胞 通透性组胺诱导的 15 ， 促进细胞增殖 人 脐静脉 内皮细胞 的表达，增加 细胞间粘附分子-1 在 人 脐静脉 内皮细胞细胞 16 ， 但有关的生物活性成分仍然不得而知。补血nm的色谱图320汤当归在都显示在监控 图。 1 。 结果发现，超过30峰，当归补血汤中检测到目前的色谱条件下（ 图1。 一个），其中五（峰1-5）分别与测定峰面积减小后，提取培养的 血管内皮细胞 （

16、图1。 乙）。 另一方面，警方在现场发现五座山峰提取物变性 内皮细胞 （ 图1。 四），与对照样品相同保留1-5倍，高峰，分别为（即无治疗 内皮细胞 ）当归补血汤（ 图1。 甲）。 同时，无峰警方在现场发现的第四洗脱液 内皮细胞 （ 图1。 丙）。 图。 2 显示或不当归补血汤的色谱的 内皮细胞 治疗（在280 nm处监测 图。二 A和B）和254纳米（ 图2。 C和D）。 可以发现，除了峰1-5，峰面积的减少与其他峰没有明显进行了测定。 这些结果表明，至少有五个组成部分补血汤中当归提取物有相互作用与 血管内皮细胞 。 和相互作用可以推断非物理吸附，但生物选择性装订，或渗透到 血管内皮细胞 。

17、 因此，这些细胞相互作用的化合物可以被看作是潜在的生物活性补血汤当归候选人的 内皮细胞 。全尺寸图片 （16K）的图。 1。 当归补血汤色谱监测在320纳米。 （一）当归补血汤提取物治疗空白的缓冲液A;（二）提取当归补血汤治疗与 血管内皮细胞 ;（三）交存第四洗脱液 内皮细胞 ;（四）变性提取物沉积 血管内皮细胞 。文章内查看全尺寸图片 （18K金）图。 2。 当归补血汤色谱监测在280和254纳米。 （A和C）：当归补血汤提取物治疗，一个空的缓冲区;（B和D）与提取当归补血汤治疗 血管内皮细胞 ：（A和B）在280 nm的监督：（C和D）监测254纳米。文章内查看黄芪 当归 当归和黄芪，补血

18、汤当归的成分，进行了调查，当归补血汤相同的方式与上述当归补血汤峰，确认捐款改变5面积。 所示 图。 三 ，二峰（峰1和2）被确定为转变峰地区药材 当归 当归，其中有5个，同时保留时间分别为4和峰，当归补血汤（ 图1。 甲）。 同样，四峰（峰1-4）进行分析的面积变化的黄芪药材中峰（ 图。4 ），其中有当归补血高峰在1-4，分别汤相同保留时间（ 图1。 甲） 。 这些结果表明，当归补血汤3（峰1，2和 图1。 甲）分别为（出资峰一，二，三，黄芪分别药材 图。4 ），而峰4当归补血汤（ 图1。 A）的基数贡献的高峰1 当归 当归（ 图。3 ）和汤（当归补血峰值5 图1。 A）的贡献都药材峰2 当归

19、 当归（ 图。3 ）和峰值4对黄芪（基数 图。4 ）。全尺寸图片 （十四K）图。 3。 药材的色谱 当归 当归监测在320纳米。 （一）中药提取物 当归 当归治疗空白的缓冲液A，（乙）中药提取物 当归 与当归治疗 内皮细胞 ;（三）交存第四洗脱液 内皮细胞 ;（四）提取物变性沉积 内皮细胞 。文章内查看全尺寸图片 （1.7万）图。 4。 黄芪药材的色谱监测在320纳米。 （一）中药黄芪提取物治疗空白的缓冲液A;（二）提取物黄芪治疗 内皮细胞 ;（三）交存第四洗脱液 内皮细胞 ;（四）提取物变性沉积 内皮细胞 。文章内查看3.2。 当归补血汤鉴定的生物活性成分的候选人和其 内皮细胞直至目前为止，

20、至少有五个类型的化合物，即分别报告了其成分，主要成分为当归补血汤或 多糖 ，黄酮类化合物（如ononoside和 毛蕊异黄酮 ），苯酞（如 藁本 和三丁基苯酞），皂甙（如黄芪甲苷），酚类（如 阿魏酸 ）等 17 ， 18 ， 19 ， 20 ， 21 和 22 。 高效液相色谱二极管阵列质谱联用技术是用来阐明当归补血汤对身份的生物活性候选人 内皮细胞 。 改变峰的身份以地区为证实了该化合物的保留时间比较和MS数据的引用与可用，或文献，在。在黄芪当归补血汤图谱和中药，以及可供参考化合物 阿魏酸 ， 藁本内酯 和 毛蕊异黄酮 在320 nm的监测都显示在 图。 5 和 图。 6 。 总离子色谱当归

21、补血汤（议会）中显示的是 图。 7 。 转变峰的质谱数据的五个地区是总结 表1 。 中药生物活性贡献的候选人峰2（5 当归 汤（当归），当归补血 图1。 A）的明确确定为 毛蕊异黄酮 和 藁 通过数据比较，保留时间和质谱化合物的基准，而1和峰四是初步文献指派为ononoside和3 -丁基苯酞，通过比较它们与海量数据 18 ， 19 ， 20 和 21 （ 图8。 ）， 但峰3，只有元素组成和分子量进行了计算，其身份仍旧是个澄清。 不幸的是，信号不敏感5足够的高峰鉴定药材黄芪出资在目前的HPLC - DAD的质谱条件。全尺寸图片 （1.2万）图。 5。 化合物色谱当归补血汤及可供参考监测在32

22、0纳米。 （一）提取当归补血汤;（二） 藁 ;（三） 阿魏酸 。文章内查看全尺寸图片 （1.3万）图。 6。 黄芪药材及可供参考化合物在320 nm处的色谱监测。 （一）提取的黄芪和（乙）calycosine。文章内查看全尺寸图片 （8K）的图。 7。 总离子色谱（议会）在当归补血汤：（一）积极模式及（b）反模式。文章内查看表1。 补血汤当归质谱数据具有生物活性的五个候选人 内皮细胞 山顶没有。 离子（+喷雾） 离子（-喷雾） 元素组成 错误 一 （百万分之一） DBE b 身份 一431.1338 M+ H条 +465.0957 M+氯 - 22 22 90.3268（+）12Ononosi

23、de2285.0764 M+ H条 +283.0631 M+氯 - 16 12 52.2795（+）11Calycosine三269.0842 M+ H条 +267.0687 M- H条 - 16 12 41.7367（+）11268.0766（兆瓦，大）4191.1068 M+ H条 +- 12 14 20.7519（+）6三丁基苯酞5191.1068 M+ H条 +- 12 14 20.7519（+）6藁全尺寸表一（+）计算由正离子。b双键的等价性。 文章内查看全尺寸图片 （21K条）图。 8。 潜在的生物活性成分的化学结构，发现当归补血汤。文章内查看据报道， 升 - 3 -丁基苯酞既可以

24、增加NO产量 牛 脑 血管内皮细胞 和 牛 主动脉 内皮细胞 ，并选择性地增加产量依前列醇 牛 主动脉 内皮细胞 23 。 毛蕊异黄酮 可保护 血管内皮细胞 由 缺氧 引起的障碍通过增加细胞内的能量障碍，促进再生资源的cAMP水平，以及改善 细胞骨架 重构 24 。 这些结果表明，三丁基苯酞和 毛蕊异黄酮 确有疗效的生物活性有关的当归补血汤治疗 贫血的 治疗，并以高概率这种结合的生物活性成分的处方，这意味着这一新的相应建议的策略可能是一个有用的途径快速筛选和分析潜在的候选人中医药生物活性。4。 结论在本研究中，质谱分析新的战略相结合的处方筛选及生物活性成分的确定中医药使用活细胞提取和HPLC

25、- DAD的，是提出并成功地应用于中药，调查潜在的生物活性候选人当归补血汤及其组成 当归 当归和黄芪的 内皮细胞 。 结果表明，这一新提议的战略可能是一个有用的方法概率高生物活性的候选人中医药与预测。致谢这项研究是由普通基金提供资金支持（第3047.216万和90209045）和重点基金（3053.087万）全国科学基金会的中国。参考文献1 克 叶，YZ李YY里，赫兹和DA郭郭， j的 医药。 生物医学。 。肛门 33 2003），页521-527。（ 条 |PDF文件（221金） | 查看Scopus纪录 | 万方图书馆论坛（22）2 米 Homma，光冈，山田吨，吨Niitsuma，阁下Ihto和N.高桥， 肛门。 生物化学。 202 （1992），页179-182。3 立法会他，资深大律师和XD王耿， Chromatographia 54 （2001），页71-76。 全文 通过CrossRef | 图书馆论坛查看记录 | 万方图书馆论坛（43）4 直流Schrie