SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用

1、SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用摘要生物大分子的活性是通过不同分子或相同分子之间的相互作用来实现其生物学功能。在结构生物学研究领域中，单纯解析生物大分子的结构已不能满足现代科研的基本要求，所以研究其生物学功能受到了越来越多的重视。本文主要介绍现在常用的SPR技术和ITC技术以及它们在结构生物学中的应用。关键词SPR技术ITC技术结构生物学前言结构生物学是前个世纪后半叶才蓬勃发展起来的重要学科，通过研究核酸、蛋白质等生物大分子的空间结构，可以为生物大分子发挥生理功能的机理提供关键解释1。生物分子之间的相互作用奠定了生物生命现象的基础，因此研究生物分子之间的相互作用可以在分子水平上更加精

2、细地阐述生物反应发生的机理，揭示生命现象的本质2。关于蛋白质相互作用的检测手段已有很多，但是其缺点也很明显。SPR（表面等离子共振）生物传感技术作为一种新兴的光学生物化学检测技术，与传统的生化分析方法相比，具有无需标记、灵敏准确、快速、能够实现在线连续检测等优点3。止匕外，在生物体中的各种生物分子之间的相互作用并不像化学反应那样剧烈。通过热力学研究，它能够在结合机制的阐明中起重要作用，为药物的设计提供合理的理论模型4。为了研究分子间弱的相互作用力，ITC（等温滴定量热分析）技术便应运而生，它在生物热力学模型的建立、蛋白质和配体的结合以及表面活性剂和聚合物的相互作用中都扮演了关键角色。SPR技术

3、SPR（表面等离子共振）是指在光波的作用下，在金属和电介质的交界面上形成的改变光波传输的谐振波6。在介质（一般为玻璃）表面涂上一层金属薄膜（一般为金属），入射光在界面处发生全内反射时，产生的消逝波渗透到金属薄膜内，可以激发金属表面等离子体使之产生等离子波。当入射光的入射角和波长在某一适当值时，表面等离子波与消逝波的频率和波数相等，此时两者将发生共振，入射光能量被吸收，反射光强大幅度减弱，可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此为共振峰，对应的入射角为SPR角2。SPR角随金属表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合的分子的质量成正比。当目标分子结合到传感器表面时（图1）,能够

4、引起SPR角度的变化，我们可以通过检测谐振角、谐振波长或谐振强度的变化来反应生物分子之间的相互作用7。7"ranucIionsignal图1光学无标记生物传感器插图7SPR的实验方法：将需要检测的分子键合到生物传感器的芯片上（该步骤可以委托公司完成），然后将蛋白分子溶液以恒定的流速流过芯片表面。如果检测的分子能够与与蛋白分子相互作用，那么生物传感器表面的质量便会增加，改变传感器表面折射率，从而使共振角度发生改变。折射率每变化1000RU,那么表示芯片表面每平方毫米有1纳克的质量发生改变网。现在实验室广泛使用的表面等离子共振传感器有Biacore系列，它们的光学检测部件一般包括光源、T

5、M波偏振器、棱镜、检测芯片、信号检测器这六个大的部分（图2）。光源发出的光经过透镜后，能产生平行的光束，透过棱镜，再检测芯片上质量的改变情况，最后的反射光经过各级的检测器、放大器进行处理，在记录仪上显示其变化情况。通过系统自带的计算软件，计算反应的平衡常数、解离常数。图2光学SPR传感系统SPR在结构生物学中的应用SPR技术在生命科学领域都有着广泛的应用，比如药物代谢分析，生物检测,免疫检测、蛋白质功能分析等。下面，主要介绍一下SPR在结构生物学上的最新应用和成果。DemeJC等9利用SPR技术研究了人类溶酶体维生素B12的两个转运子LMBD1和ABCD4功能的结合特性，实验表明：LMBD1和

6、ABCD4有低纳摩尔亲和相互作用；细胞质维生素B12进程蛋白MMACHC与LMBD1和ABCD4也有低纳摩尔亲和相互作用。LandryJP等10报道了一个使用SPR技术，利用高通量的方法测量单克隆抗体的亲和力。他们测量了超过1410种兔的单克隆抗体和46种小鼠的单克隆抗体的亲和常数，实验测得的亲和常数变化范围在10200pM之间，平均值在66pM。这一实验，为单克隆抗体在疾病的诊断和试剂的研究提供了基础。HuangY等11使用SPR研究了RGD-水蛭素与凝血酶的结合常数。实验结果表明，RGD-水蛭素的六个突变体与凝血酶的Kd值高于野生型，这个发现有助于新型的RGD-水蛭素与凝血酶的相互作用的理

7、解。等温滴定量热法等温滴定量热法（IsothermalTitrationCalorimetry,ITC）是根据热效应随时间变化特征确定化学反应动力学行为的一种先进的现代测量技术。在类似于化学滴定的过程中，通过测量滴定过程中分子之间热量的释放和吸收，跟踪化学反应的反应热量随着时间的变化而变化12,ITC技术提供了一个快速、精确地测量分子相互作用的实验方法13。在单个实验中，ITC技术能够测定分子之间的亲和力常数K,化学计量数N、始变H以及反应嫡变SoITC实验仪器重要由主机和控制器组成。控制器为安装有控制软件的电脑，主机包括塔台，样品注射器，测量池、样品池以及清洗单元等部件组成（图3）。40微升

8、的注射器中装配体小分子，样品池为蛋白样品（对ITC200型号的样品池，工作体积为200微升，但是需要向样品池中加入280微升的样品），参比池中通常加入等体积的水。实验开始时，系统给样品池和参比池一个能量，保证两个池子中的温度相等。当注射器中的配体与样品结合的时候，其产生或者吸收了热量，使两个池中的温度平衡被打破。这时系统通过减少能量供给或者增加能量输入，保证两个池中的温度达到平衡，输出的数据即为系统的能量变化情况。实验结果是通过每次滴定过后能量变化的情况，用origin软件进行拟合计算。关于C值。C值的定义是C=样品池浓度N/D准确的浓度定量与滴定实验一样重要。如果C值太低，始变小和化学计量比

9、N将不准确；小分子实验却通常不得不采用低的C值；假如C值太低，可以通过提高样品池浓度来对实验进行优化。实验证明，如果样品池中浓度超过其KD值的2-10倍时，低C值的滴定是可靠的7。但是，一旦C值过高，由于没有足够的数据点描述综合的饱和过程，因此由数据拟合得到的K值不准确。合适的C值带来理想的拟合曲线。当C值在10-100之间时，我们认为这是一个很好的实验条件。图3ITC实验装置图2ITC在结构生物学中的应用蛋白质、核酸等生物大分子不论它们的分子间或分子内的生物化学反应，在反应过程中总会伴随着一定程度的热量变化，这在很大程度上为ITC技术在它们的研究中提供了理论基础。从最新的研究进展来看，ITC

10、技术已经被广泛的应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-小分子相互作用，蛋白质-核酸相互作用等各方面的研究中。王雪松等14总结了ITC在淀粉样蛋白的研究中的一些基本成果。比如使用ITC对AB纤维的形成机理进行了解释，认为AB在聚集过程中从具有二级结构的状态转化为以&折叠形态起始的纤维是一个二态过程；使用ITC证明质膜可以使AB的聚集加快；通过测定金属离子与AB的结合，发现了铜离子与AB结合的两个结合位点，并对这两个位点各自的解离常数进行了计算。杨少梅等15研究了人血清白蛋白与抗癌药紫杉醇的相互作用，使用ITC技术，计算了两者结合的始变、嫡变，化学计量数等一系列数值，说明二者的非特异性结合

11、有利于紫杉醇在血液中的运输与交换，为紫杉醇在血液中的运输提供理论支持。杨炳君16使用ITC技术与光谱学技术结合，研究了谷胱甘肽包被的CdTe量子点与血清白蛋白、过氧化氢酶以及铜/锌-SOD的相互作用，表明CdTe量子点与这三种蛋白质是以疏水作用力结合，且结合后的两种抗氧化酶类催化功能未受到影响AndrasiM等17使用各种不同的方法研究抗人白蛋白单克隆抗体和其抗原蛋白之间的相互作用，实验表明由ITC获得的解离常数数值与使用ACE（一种研究分子结合的方法）获得的值是一致的。BrathU等18在研究钙调蛋白中与麻醉剂七氟醴的结合位点时，使用了ITC去测量它们之间的亲和力。实验表明，七氟醴在同与钙离

12、子结合的钙调蛋白作用时，有低的亲和力，然而当缺乏钙离子时，它们之间没有相互作用。除此之外，ITC还用在其他许多研究领域。比如冯雪等19采用等温滴定量热法考察了益气复脉冻干干粉针与VC注射液及5%的葡萄糖注射液之间的相容性。实验结果表明，根据产生了的能量变化大小，益气复脉冻干干粉与VC注射液的反应属于化学反应范畴，而益气复脉冻干干粉与葡萄糖注射液的反应属于扩散引起的物理变化。讨论与展望以上两种实验研究方法因其优越性已经越来越多地用于结构生物学的研究之中，但是，以上两种方法也有各自的问题需要解决。SPR技术待测的分子只局限于大分子，小分子会对其造成严重的误差；对于金属芯片的要求也比较严格；不能消除

13、非特异性结合带来的影响。ITC技术很少能够与其他仪器联合，缺乏特异性，对样品组成要求很高。两种技术共有的问题是这两种仪器都很昂贵，成本较高。以上这些缺点都限制了它们的发展。我们有理由相信，在今后的研究中，随着这这两种技术越来越完善，它们的应用必将得到更多的发展，其前景也会越来越广阔。参考文献1王宏伟.冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望J.中国科学:生命科学,2014,10:1020-10282孙小婷，靳岚，凌沛学.表面等离子共振和等温滴定量热技术及其在蛋白质相互作用中的应用J.药物生物技术，2012,06:540-5453孟庆石，劳文燕，潘映红.表面等离子共振生物传感器技术及在生命研

14、究中的应用J.生命科学仪器，2009,01:10-134PerozzoR,FolkersG,ScapozzaL.Thermodynamicsofprotein-ligandinteractions:history,presence,andfutureaspectsJ.JReceptSignalTransductRes,2004,24(1-2):1-525娄朋晓，王玉洁，白光月，等.表面活性剂分子间弱相互作用的直接能量表征高灵敏等温滴定量热法J.ActaPhys.Chim.Sin,2013,296符运良，傅军，吴英才，袁一方.表面等离子共振传感技术的发展与应用J.激光杂志,2006,06:15-

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17、porters:LMBD1andABCD4J.MolMembrboil.2014Nov,31(7-8):250-26110J.P.Landry,YaohuangKe,Guo-LiangYu,X.D.Zhu,Measuringaffinityconstantsof1450monoclonalantibodiestopeptidetargetswithamicroarray-basedlabel-freeassayplatform,JournalofImmunologicalMethods,Availableonline20December2014,ISSN0022-175911HuangY,Zh

18、angYZhaoB,XuQ,ZhouX,SongH,YuM,MoW.StructuralbasisofRGD-hirudinbindingtothrombin:Tyr3andfiveC-terminalresiduesarecrucialforinhibitingthrombinactivityJ.BMCStructBiol,2014Dec20,14(1):2612宋熙熙，邵爽，雷群芳，等.等温滴定量热法测定月尿酶催化尿素水解反应动力学J.浙江大学学报:理学版，2009,36(2):175-17913GhaiR,FalconerRJ,CollinsBM.Applicationsofisothermaltitrationcalorimetryinpureandappliedresearchsurveyoftheliteraturefrom2010J.Jour