12十二核酸的生物合成

1、一、一、DNA的生物合成的生物合成二、二、RNA的生物合成的生物合成40年代末，经过一系列精彩实验证明了DNA是多数生物的遗传物质。1953年，Watson和Crick提出了DNA的双螺旋模型，并设想了DNA是如何复制的，也就是说，在DNA分子上实现了生物的繁殖过程。这是具有划时代的意义的。1958年，Crick又提出了生物分子遗传的中心法则，为生命活动理清了思路。中心法则的建立，是生命科学发展的里程碑。虽然以后经过一些修改和补充，但是它已经成为生命科学最根本的法则。生物体的遗传信息储存在生物体的遗传信息储存在DNA中，并中，并通过通过DNA的复制由亲代传给子代。在的复制由亲代传给子代。在子代

2、的生长发育中遗传信息自子代的生长发育中遗传信息自DNA转转录给录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。相似的遗传性状。1958年，年，F.Crick提出中心法则：提出中心法则：（1）以原）以原DNA分子为模板，合成出分子为模板，合成出相同相同DNA分子的过程。分子的过程。（2）以某一段）以某一段DNA分子为模板，合分子为模板，合成出与其序列对应的成出与其序列对应的RNA分子的过程分子的过程。（3）以）以mRNA为模板，根据三联密码为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。规则，合成对应蛋白质

3、的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。传递方向。中心法则： 本章的主要任务就是要回答中心法则的第一部分：DNA分子是如何复制的，其细节是什么？子代DNA为什么能够真实地获得亲代DNA的遗传信息？生物体是如何对DNA复制进行调控的？ 中心法则中的DNA复制（replication)，实质上就是要解决生物如何将遗传信息传递的子代的问题，也就是以原来的DNA分子为模板合成相同的DNA分子的过程。转录(transcription)就是在DNA分子上的某一段生物“语言”即DNA序列转录为RNA的过程。所谓翻译(translation)则是在信使RNA(mRNA

4、)的指导下将核苷酸的排列顺序翻译成氨基酸排列顺序（蛋白质）的过程。少数生物以RNA为遗传物质，它们可以以RNA为模板反转录为cDNA，也可以直接以RNA为模板进行复制，并翻译蛋白质。DNA生物合成有两种方式：生物合成有两种方式：DNA复制和反转录复制和反转录 DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状） DNA的体外复制：分子克隆。的体外复制：分子克隆。 原核生物每个细胞只有一个染色体，即细胞核基因组，也就是

5、一个DNA分子。虽然原核生物有的还含有核基因组以外的环形DNA(如质粒，plasmids)，但是质粒的DNA相对核基因组要小得多。真核生物每个细胞含有多条染色体，每条染色体中有一个DNA分子。在细胞增值的过程中，基因组要发生精确的复制，然后在细胞分裂时等分到每个子细胞中去。染色体复制的实质是DNA分子的复制。 染色体以外的遗传因子，包括细菌的质粒、真核细胞的细胞器等，其遗传物质的复制有的受核基因组控制，有的则不受核基因组的控制。例如有的细菌的质粒，每个细胞中只有一个或几个拷贝，称为单拷贝质粒，该控制为严紧控制(stringent control)，有的质粒则在每个细胞中有20个以上的拷贝，称此

6、为松弛控制(relaxed control)质粒，又称为多拷贝质粒。 核基因组DNA复制发生在细胞分裂的S期，但是核基因组以外的DNA是否进入复制则是随机的。因而有些DNA分子在一个细胞周期中并不是复制一次，有些则不发生复制。例如对于植物来讲，其根尖生长点，由于细胞复制和分裂速度很快，而寄生于其中的病毒则仍然按照自己的速度进行复制，所以通过取一小段根尖进行快速组织培养繁殖，即可能获得脱毒(不含病毒)的植株。返回DNA的半保留复制的半保留复制(semiconservative replication)Watson和和Crick在提出在提出DNA双螺旋结构双螺旋结构模型时即推测，模型时即推测，DN

7、A在复制时首先两条在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代链，这样新合成的子代DNA分子中分子中一条链来自亲代一条链来自亲代DNA，另一条链是新合，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。成的，这种复制方式为半保留复制。科学家同时还设想了其它可能的复制模型 虽然Watson 和Crick推测了DNA的复制可能是半保留的，但是并没有拿出任何实验证据，而生命科学的每一个理论都必需经过实验证明才能得到公认。 1958年Meselson 和Stahl利用同位素

8、15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了其DNA复制的确是半保留的。 此后，大量的实验都证明了原核生物和真核生物DNA都是半保留复制的。然而真正用电子显微镜观察到DNA的复制过程还是在1963年由Cairns作出的。他用3H标记大肠杆菌DNA经过两代之后，用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的染色体DNA释放出来，铺在一张透析膜上，用感光乳胶片感光，显影后在电子显微镜下观察，由于3H可以释放出弱射线，所以在显影后的乳胶片上显示出的银颗粒勾画出了DNA分子的轮廓，黑点的数目代表了3H在DNA分子中的密度。从而在电子显微镜下，Cairns直接观察到了DNA的半保留复制。 此后，大量的实验都证明了原核生物和真

9、核生物DNA都是半保留复制的。然而真正用电子显微镜观察到DNA的复制过程还是在1963年由Cairns作出的。他用3H标记大肠杆菌DNA经过两代之后，用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的染色体DNA释放出来，铺在一张透析膜上，用感光乳胶片感光，显影后在电子显微镜下观察，由于3H可以释放出弱射线，所以在显影后的乳胶片上显示出的银颗粒勾画出了DNA分子的轮廓，黑点的数目代表了3H在DNA分子中的密度。从而在电子显微镜下，Cairns直接观察到了DNA的半保留复制。2居中居中重重轻轻01341958年，年，Meselson和和Stahl用用15N标记标记E.coli. DNA，证明了证明了DNA的复制是

10、半保留复制。的复制是半保留复制。复制起始点是以一条链为模板起始复制起始点是以一条链为模板起始DNA合成合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如总是在同一点上（如D环复制）。环复制）。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含区段，富含A.T。 定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或

11、异速进行），定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。用放射自显影实验判断用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度的复制方向及速度 低放射性低放射性3H-脱氧胸苷脱氧胸苷 高放射性高放射性3H-脱氧胸苷脱氧胸苷a. 单向单向b. 双向等速双向等速 三种结果图形三种结果图形c. 双向异速双向异速E.coli.的一个温度敏感株，在的一个温度敏感株，在42时，能使时，能使DNA在完成复制后，在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在不再开始新的复制过程，而在25时复制功又能能恢复。时复制功又

12、能能恢复。直线双向复制直线双向复制 单点，双向，单点，双向，T7 多点，双向，真核染色体多点，双向，真核染色体DNA型复制：环状双链型复制：环状双链DNA，单向或双向（，单向或双向（E .coli.）滚环复制：环状单链滚环复制：环状单链DNA，x174D环复制：线粒体、叶绿体环复制：线粒体、叶绿体DNA多复制叉复制：多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。在在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA的的复制最快可达复制最快可达50Kb/min，完全复制需，完全复

13、制需40min，富营养时，富营养时，20min分裂。而真核染色体要分裂。而真核染色体要6-8小时。小时。 复制子复制子(Replicon)基因组能独立进行复制的单位每个复制子都含有一基因组能独立进行复制的单位每个复制子都含有一个复制起点。个复制起点。 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不

14、对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。 环状环状DNA的复制眼象的复制眼象，称，称形复制。形复制。 真核生物的染色体真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体。人体细胞平均每个染色体含有含有1000个复制子。个复制子。 病毒病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。v DNA聚合酶聚合酶v DNA模板模板(反转录时用反转录时用RN

15、A模板模板v 引物引物 (DNA、RNA或蛋白质或蛋白质)v 4种种dNTPv Mg2+ 在链的延长过程中，链的游离在链的延长过程中，链的游离3 3，- -羟基，对进入的脱氧核糖羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸核苷三磷酸磷原子发生亲核攻击，生成磷原子发生亲核攻击，生成3 3，.5.5，- -磷酸二酯磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。键，并脱下焦磷酸。DNA聚合酶的反应特点：聚合酶的反应特点： 以以4种种dNTP为底物为底物 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。的聚合。 反应需有引物反应需有引物3，-羟基存在羟基存在 链生长方向链生长方向5， 3，

16、 产物产物DNA的性质与模板相同的性质与模板相同v 发荚环结构：加入单链发荚环结构：加入单链DNADNA作为模板和引物，作为模板和引物，33羟基端回折成引物链。羟基端回折成引物链。v 末端延伸聚合：加入双链末端延伸聚合：加入双链DNADNA作为模板和引物，作为模板和引物，33末端突出作为模板。末端突出作为模板。v 分枝型和切口平移型聚合：加入双链分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNADNA，聚合，聚合发生在切口或末端单链区。发生在切口或末端单链区。v 环形聚合：加入带引物的环形环形聚合：加入带引物的环形DNADNA作为模板。作为模板。 双链双链DNA复制的分子机制：复制的分子机制： 冈崎片断和

17、半不连续复制冈崎片断和半不连续复制 冈崎片断和冈崎片断和RNA引物引物 DNA连接酶连接酶 母本母本DNA双链的分离双链的分离 聚合酶的校对作用聚合酶的校对作用DNA的聚合反应和聚合酶1、DNA聚合酶I 虽然我们已经证明并观察到DNA的半保留复制，但是负责DNA复制的到底是什么？能否找到DNA复制的酶？仍然需要科学来解决。1956年，Kornberg等首先从大肠杆菌提取液中发现DNA聚合酶，后来在大量生物中都分离到了具有DNA复制能力的酶，称为DNA聚合酶，也叫做依赖于DNA的DNA聚合酶。Kornberg在大肠杆菌中所发现的DNA聚合酶为DNA聚合酶I其催化反应如下：KornbergsE.c

18、oli. DNA pol.I（Kornberg酶，酶，400 copy/cell）E.coli. DNA Pol.（100 copy/cell)E.coli.NA pol.（复制酶，（复制酶，10-20 copy/cell）v单体酶，分子量单体酶，分子量109Kd109Kd，含一个，含一个Zn2+Zn2+，每个细胞中含，每个细胞中含400400个个DNA pol.DNA pol.催化活性：催化活性： 5 5， 3 3， 聚合活性聚合活性 3 3， 5 5， 外切活性外切活性 5 5， 3 3， 外切活性外切活性v用蛋白水解酶将用蛋白水解酶将DNA pol.DNA pol.部分水解可得：部分水解

19、可得： 大片段（大片段（KlenowKlenow），），75Kd75Kd，活性：，活性：5 5， 3 3，聚合活性、，聚合活性、3 3， 5 5，外切活性。外切活性。 小片段，小片段，36Kd36Kd，活性：，活性：5 5， 3 3，外切活性（只作用于双链，外切活性（只作用于双链DNADNA的碱的碱基配对部分，切除修复）。基配对部分，切除修复）。vKlenowKlenow片段的用途：片段的用途：a a 补齐补齐DNA 3DNA 3，隐缩未端，隐缩未端 b. b. 标记标记DNADNA片段未端片段未端 c ccDNAcDNA合成第二链合成第二链 d dd DNAd DNA测序测序 E.coli.

20、 DNA pol.I 经过对DNA polymerase I进行详细研究表明，其反应特征为：1、以四种脱氧核苷三磷酸为底物，通过水解焦磷酸提供能量。2、反应需要接受模板的指导。3、反应需要引物3羟基的存在。4、DNA的生长方向为53。5、产物DNA的性质与模板相同。 DNA聚合酶I是一个多功能酶。它可以催化下列反应：1、 53聚合活性，催化新合成的DNA链沿5到3方向延伸。2、3 5核酸外切酶活性。3、 53核酸外切酶活性。4、3 端使DNA链发生焦磷酸解，即聚合反应的逆反应。5、无机磷酸盐与脱氧核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换。DNA polymerase I ： Klenow fragment

21、 DNA聚合酶的35核酸外切酶活性对于DNA复制的忠实性是极为重要的，如果没有此活性，则DNA复制的出错率将明显增高。例如某些变异的T4噬菌体突变率很高，分离出的此种噬菌体的DNA聚合酶的35外切酶活性很弱。所分离到的抗突变能力很低的T4噬菌体的DNA聚合酶，其35活性则很高，所以科学家断定DNA聚合酶的35外切酶活性是负责对复制的DNA起校对作用的。 2、DNA聚合酶II 1969年Delucia 和Cairns 分离到一个大肠杆菌变异株，其DNA聚合酶I的活力极低，仅为野生型的0.5%1%，但是它可以正常繁殖由此人们怀疑DNA聚合酶I可能不少生物复制所需的主要酶，它的主要作用是对损伤起修复

22、作用。1970年和1971年先后分离到另外两种DNA聚合酶，定名为DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。E.coli. DNA Pol. DNA聚合酶聚合酶II 1969年年Delucia 和和Cairns 分离到一个大肠杆分离到一个大肠杆菌变异株，其菌变异株，其DNA聚合酶聚合酶I的的活力极低，仅为野生型的活力极低，仅为野生型的0.5%1%，但是它可以正常，但是它可以正常繁殖由此人们怀疑繁殖由此人们怀疑DNA聚合聚合酶酶I可能不少生物复制所需的可能不少生物复制所需的主要酶，它的主要作用是对主要酶，它的主要作用是对损伤起修复作用。损伤起修复作用。DNA聚合聚合酶酶II由一条分子量为由一条分子量

23、为120kd的的多肽链组成。其聚合酶活力多肽链组成。其聚合酶活力很低，只相当于很低，只相当于DNA聚合酶聚合酶I的的1-5，它具有，它具有35外切酶外切酶活性，但无活性，但无53外切酶活性。外切酶活性。该酶的缺陷型大肠杆菌，仍该酶的缺陷型大肠杆菌，仍然可以正常进行然可以正常进行DNA复制，复制，说明它不是复制所需主要说明它不是复制所需主要DNA聚合酶，其作用不祥，聚合酶，其作用不祥，可能在损伤修复中起某种作可能在损伤修复中起某种作用。用。1970年和年和1971年先后分离到另年先后分离到另外一种外一种DNA聚合酶，定名为聚合酶，定名为DNA聚合酶聚合酶III。v 单体酶，分子量单体酶，分子量1

24、20Kd120Kdv 催化活性：催化活性：v 5 5， 3 3，聚合，聚合( (活性很低活性很低) ) 3 3， 5 5，外切，外切v 可能在可能在DNADNA的修复中起某中作用的修复中起某中作用 寡聚酶，全酶由寡聚酶，全酶由1010种共种共2222个亚基组成，个亚基组成，、和和三种亚基组成核心酶。三种亚基组成核心酶。DNA pol.DNA pol.是合成新链是合成新链DNADNA主要的酶，又称复主要的酶，又称复制酶制酶(Replicase)(Replicase) Pol.Pol.的的5 5，33，外切酶活性只作用于单链，外切酶活性只作用于单链DNADNA。 E.coli.DNA pol. E

25、.coli.DNA pol.的组成的组成DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶分子量分子量109KD120KD600KD每个细胞中的分子数每个细胞中的分子数40017-10010-2053聚合活性聚合活性+37转化率核苷酸数转化率核苷酸数酶分子酶分子分钟分钟6003030,00053外切活性外切活性+-35外切活性外切活性+切刻平移活性切刻平移活性+-对对dNTP亲和力亲和力低低低低高高功能功能修复修复复制复制修复修复去除引物去除引物填补空缺填补空缺细胞内，细胞内，DNADNA的复制需要引物（的复制需要引物（DNADNA或或RNARNA），引），引物酶或物酶或RNARNA聚

26、合酶可合成聚合酶可合成6-106-10个碱基的个碱基的RNARNA引物引物。DNADNA复制为什么要用复制为什么要用RNARNA引物？（为什么引物？（为什么DNADNA聚聚合酶要用引物，合酶要用引物，RNARNA聚合酶不需要引物？）聚合酶不需要引物？）从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，定双链，DNADNA聚合酶的聚合酶的5 5，33，校对功能难发挥，校对功能难发挥作用。作用。 大肠杆菌的解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶、与与re

27、prep蛋蛋白共同作用，将白共同作用，将DNADNA两条链解开。两条链解开。 解螺旋酶解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿着模板链的沿着模板链的5353方向随着复制叉的前进而移动，方向随着复制叉的前进而移动，而而reprep蛋白则在另一条模板链上沿蛋白则在另一条模板链上沿3535方向移动。方向移动。属属DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：拓扑异构酶分两类：I I和和IIII，广泛存在于原核生物，广泛存在于原核生物和真核生物。和真核生物。拓扑异构酶拓扑异构酶I I使使DNADNA

28、的一条链发生断裂和再连接，反的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。有关。拓扑异构酶拓扑异构酶使使DNADNA的两条链同时断裂和再连接，的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由当它引入超螺旋时需要由ATPATP供给能量。分布在染供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。 复制叉上的解螺旋酶，沿双链复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNADNA前进，产生单链区，大量的单链前进，产生单链区，大量的单链DNADNA结合蛋白与单链区结合，阻止结合蛋白与单链区结合，阻止复性和

29、保护单链复性和保护单链DNADNA不被核酸酶降不被核酸酶降解。解。三、DNA连接酶 科学家发现，所有的DNA聚合酶都只能催化核苷酸链的延长反应，不能使链之间连接。所以，科学家推断，细胞内必定存在着一种连接酶，催化DNA末端之间的连接。1967年几个实验室同时发现了DNA连接酶(DNA ligase)，催化双链DNA切口处的5磷酸基和3羟基生成磷酸二酯键。DNA连接所需能量，细菌由NADHH+提供能量；动物细胞和噬菌体以ATP作为能量来源。反应分三步进行：首先NADHH+或ATP与酶反应，形成复合物，例如和ATP形成酶AMP复合物，AMP的磷酸基与酶的赖氨酸的氨基以磷酰胺键结合，然后酶将AMP转

30、移给DNA切口处的5磷酸，以焦磷酸的形式活化，形成A-P-P-DNA，然后通过相邻链的3OH对活化的磷原子发生亲核攻击，生成3，5磷酸二酯键，同时释放出AMP。连接双链连接双链DNADNA上的切口。上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNADNA缺口缺口。T4DNA ligaseT4DNA ligase即可连接粘性末端的即可连接粘性末端的DNADNA，又可连接平齐末端的双链又可连接平齐末端的双链DNADNA。E.coli.E.coli.和其它细菌的和其它细菌的DNA ligaseDNA ligase以以NADNAD为为能源，动物细胞和噬菌体能源，动物细胞和噬菌

31、体DNA ligaseDNA ligase以以ATPATP为能源。为能源。 模板模板DNADNA结合位点结合位点 引物结合位点引物结合位点 引物引物3 3，-OH-OH位点、反应位点位点、反应位点 底物底物dNTPdNTP结合位点结合位点 5 5， 3 3， 外切位点外切位点(pol.(pol.没有没有) ) 3 3， 5 5， 外切位点外切位点( (校正校正) )（二）真核生物DNA聚合酶 在发现上述大肠杆菌DNA聚合酶之后不久，科学家又从小牛胸腺中分离到了真核生物的DNA聚合酶。大量的研究表明，真核生物细胞中存在四种DNA聚合酶，分别以、和来命名。如下表：DNA聚聚合合酶酶 DNA聚聚合合

32、酶酶 DNA聚聚合合酶酶 DNA聚聚合合酶酶 分分子子量量110-220kd45kd60kd122kd亚亚基基数数多个1个1个1个细细胞胞内内分分布布细胞核细胞核细胞核和线粒体细胞质酶酶活活力力/总总活活力力8010152151025核核酸酸外外切切酶酶活活力力无无无35外切酶真核生物DNA聚合酶 真核生物的DNA聚合酶可能是真核生物的复制酶，它需要3引物。聚合酶可能在DNA修复中起重要作用。聚合酶可能与线粒体DNA复制有关。真核真核DNADNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在酶在DNADNA复制中起校正功能。复制中起校正功能。 DNA DNA聚

33、合酶聚合酶，多亚基，功能与，多亚基，功能与E.coli. pol.E.coli. pol.类似，是真核类似，是真核DNADNA复制酶。复制酶。 DNA DNA聚合酶聚合酶，主要在，主要在DNADNA损伤的修复中起作用损伤的修复中起作用。 DNA DNA聚合酶聚合酶，从线粒体得到，可能与线粒体，从线粒体得到，可能与线粒体DNADNA的复制有关。的复制有关。 DNA DNA聚合酶聚合酶，特点：有，特点：有3 3， 5 5，外切活力。，外切活力。 亚基数亚基数44425分子量（分子量（KD)25036-38160-300170256细胞内定位细胞内定位核核核核线粒体线粒体核核核核53聚合活性聚合活性

34、35外切活性外切活性 功能功能复制、引发复制、引发修复修复复制复制复制复制修复修复冈崎片断和半不连续复制冈崎片断和半不连续复制 按照按照Watson-Crick假说假说DNA 两条链的方向相反如果两条链的方向相反如果DNA的一的一条链从条链从53合成，则另一条链必须从合成，则另一条链必须从3-5延伸。延伸。 1968年冈崎等人用年冈崎等人用3H脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大肠杆菌发脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大肠杆菌发现短期内先合成的是较短的现短期内先合成的是较短的DNA片断接着出现大分子片断接着出现大分子 新新DNA的一条链是按的一条链是按53方向合成的，称为方向合成的，称为“前导链前导链”该片该片

35、段的合成是连续的。另一条链的合成是不连续的先合成若干片段的合成是连续的。另一条链的合成是不连续的先合成若干片断再通过酶的作用形成第二条新链，称为断再通过酶的作用形成第二条新链，称为“后随链后随链”冈崎片段长度：冈崎片段长度：细菌：细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。，相当于一个顺反子的大小。真核：真核：100-200bp，约等于一个核小体，约等于一个核小体DNA的长度。的长度。 冈崎片断和半不连续复制冈崎片断和半不连续复制引发：当引发：当DNADNA的双螺旋解开后，合成的双螺旋解开后，合成RNARNA引物的过程。引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（引发体：引物合成酶与各种

36、蛋白质因子（dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、n nn nI I）构成的复合体，负责）构成的复合体，负责RNARNA引物的合成。引物的合成。引发体沿着模板链引发体沿着模板链5353方向移动（与冈崎片段合成方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发一定位置上即可引发RNARNA引物的合成。引物的合成。E.coli.DNAE.coli.DNA复制原点复制原点ori Cori C，由，由245bp245bp组成，三组组成，三组13bp13bp重重复序列（近复序列（近5 5，端处），四组，端处），

37、四组9 bp9 bp重复序列（另一端处）重复序列（另一端处）。 大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质 DNaA 在原点处打开双螺旋在原点处打开双螺旋 DNaB 使使DNA解旋解旋 DNaC DNaB结合在原点所需结合在原点所需 Hu 刺激起始刺激起始 引物酶（引物酶（DNaG） 合成合成RNA引物引物 SSB 结合单链结合单链DNA RNA聚合酶聚合酶 促进促进DNaA活性旋转酶活性旋转酶 松驰松驰DNA扭曲应力扭曲应力20个个DnaA结合在四组结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。环绕此复合物。 三组三组13bp重

38、复区依次变性，产生开放型复合物。重复区依次变性，产生开放型复合物。 DnaB（在（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链。协助下）与开放复合物结合，进一步解链。 大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质前导链只需要一个前导链只需要一个RNARNA引物，后随链的每一个冈崎片引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个段都需要一个RNARNA引物，链的延长反应由引物，链的延长反应由DNA DNA pol.pol.催化。催化。 复制体：在复制体：在DNADNA合成的生长点（既复制叉上）分布着合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在许多与复制有

39、关的酶和辅助因子，它们在DNADNA的模板的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。制，称为复制体。 复制体沿着复制叉方向前进就合成复制体沿着复制叉方向前进就合成DNADNA。 DNA pol的的5，3，外切活力，切除，外切活力，切除RNA引物。引物。DNApol的的5，3，合成活性补齐缺口。，合成活性补齐缺口。 DNA ligase，动物、真核由，动物、真核由ATP供能，原核由供能，原核由NAD供能。供能。 催化一条催化一条DNA链的链的3末端与相邻的另一条末端与相邻的另一条DNA链的链的5末端之间的磷酸二酯键的合成。其它末

40、端之间的磷酸二酯键的合成。其它功能：功能：（1）修补双螺旋）修补双螺旋DNA中单股的缺口；中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋）连接线状双螺旋DNA以产生环状以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段）重组过程中将几段DNA链连接起来。链连接起来。母本母本DNA双链的分离双链的分离聚合酶的校对作用聚合酶的校对作用参见课本参见课本P252 图图12-9复制的准确性高于转录和转译过程。复制的准确性高于转录和转译过程。环状环状DNADNA、线性、线性DNADNA，复制叉相遇，复制叉相遇即终止。即终止。 DNA解螺旋酶解开双链解螺旋酶解开双链DNA。 SSB结合于结合于DNA单链。单链。 DNA旋转酶引入

41、负超螺旋，消除复制叉前进时带来的旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。扭曲张力。 DNA引物酶引物酶(在引发体中在引发体中)合成合成RNA引物。引物。 DNA pol.在两条新生链上合成在两条新生链上合成DNA。 DNA pol切除切除RNA引物，并补上引物，并补上DNA。 DNA ligase连接一个冈崎片段。连接一个冈崎片段。 DNA复制过程中，聚合酶对复制过程中，聚合酶对dTTP和和dUTP的分辨能力高的分辨能力高,有少量有少量dUTP掺入掺入DNA链中，此时，链中，此时，U-糖苷酶、糖苷酶、AP内切内切酶、酶、DNA pol、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接共

42、同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。上正确的碱基。真核生物染色体真核生物染色体DNADNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp100-200bp之间，比之间，比细菌染色体细菌染色体DNADNA（单复制子）小得多。（单复制子）小得多。试验证据：试验证据：5-5-氟脱氧胞苷标记氟脱氧胞苷标记真核生物真核生物DNADNA复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟叉移动的速度每分钟1-3Kb1-3Kb，细菌每分钟，细菌

43、每分钟5Kb5Kb。真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb40kb，成体细胞只利用，成体细胞只利用一部分复制起点。一部分复制起点。 核小体的

44、结构（核小体的结构（200bp200bp左右）左右）在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNADNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，小体。因此，DNADNA的复制是半保留的，而组蛋白则是的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。全保留的。试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察镜下观察反转录酶的作用是以反转录酶的作用是以dNTP为底物，

45、以为底物，以RNA为模板，为模板，tRNA(主要是色氨酸主要是色氨酸tRNA)为引物，在为引物，在tRNA3OH末末端上，按端上，按53方向，合成一条与方向，合成一条与RNA模板互补的模板互补的DNA单链，这条单链，这条DNA单链叫做互补单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与，它与RNA模板模板形成形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉，水解掉RNA链，再以链，再以cDNA为模板合成第二条为模板合成第二条DNA链。至此，完成由链。至此，完成由RNA指导的指导的DNA合成过程合成过程大多数反转录酶都具有多种酶

46、活性，主要包括以下几种活性大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性: DNA聚合酶活性；以聚合酶活性；以RNA为模板，催化为模板，催化dNTP聚合成聚合成DNA的过程。此酶需的过程。此酶需要要RNA为引物，多为色氨酸的为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物，在引物tRNA3末端以末端以53方向合方向合成成DNA。反转录酶中不具有。反转录酶中不具有35外切酶活性，因此没有校正功能，所以由外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。出错率比较高。 RNase H活性；由反转录酶催化合成的活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板与模板RNA形

47、成的杂交分子形成的杂交分子，将由，将由RNase H从从RNA5端水解掉端水解掉RNA分子。分子。 DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，单链为模板，以以dNTP为底物，再合成第二条为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。中有关。 反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重

48、要的工具酶。用组织细胞提取重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出，由此可构建出cDNA文库文库(cDNA library)，从，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。法。错配修复（错配修复（mismatch Repair） 错配修复对错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子链中的子链中的错配几乎完全都被修正，充分反映了母链的重要性错配几

49、乎完全都被修正，充分反映了母链的重要性碱基切除修复（碱基切除修复（Base-Excision Repair） DNA gylcosylases能特异性识别常见的能特异性识别常见的DNA损伤（如胞嘧啶或腺损伤（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为被称为AP位点（位点（apurinic or apyrimidinic）。细胞中最常见的）。细胞中最常见的Uracil Glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（nucleoti

50、de-excision repair） 当当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，由核苷酸切除修复系统负责进行修复成氢键，由核苷酸切除修复系统负责进行修复DNA的直接修复（的直接修复（Direct repair）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对称性。限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对称性。限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。5GTTAAC33CAATTG55GTT AAC33CAA TTG5平头末端平头末端Hpa 5GAATT

51、C33CTTAAG55G A ATTC33CTTAA G5粘性末端粘性末端EcoR1985年年A.K.Saiki等首先报道了等首先报道了PCR（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应）551 热变性热变性2 退火退火55553 DNA聚合酶聚合酶5555重复重复1，2，3PCR反应全过程反应全过程RNA的生物合成包括转录和的生物合成包括转录和RNA的复制。的复制。转录（转录（transcription）：以一段）：以一段DNA的遗传信息为的遗传信息为模板，在模板，在RNA聚合酶作用下，合成出对应的聚合酶作用下，合成出对应的RNA的过程，或在的过程，或在DNA指导下合成指导下合成RNA。转录产物：转录

52、产物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小、小RNA除某些病毒基因组除某些病毒基因组RNA外，绝大多数外，绝大多数RNA分子都分子都来自来自DNA转录的产物。转录的产物。 在DNA指导下的RNA合成 DNA指导下的RNA合成称为转录。转录起始于DNA的一个特定位置（固定的序列），称之为转录起始位点；转录中止于固定的位点，称之为中止子。对于原核生物，一个转录单元往往包含几个基因称为多顺反子，而且转录和翻译同时进行。而对于真核生物则每个转录单元只有一个基因，甚至只有一个基因的一部分，故真核生物为单顺反子；而且真核生物转录和翻译是分开进行的，即在细胞核中转录在细胞质中翻译。 转录的起始是由DNA的启

53、动子（Promoter)控制的，而中止则是终止子(Terminator)控制的。要了解转录的机制，必须找到转录酶，目前已经找到了原核和真核生物的转录酶，转录的机制也已经基本搞清楚。RNA聚合酶聚合酶 转录过程转录过程 转录后加工转录后加工 转录的调控转录的调控 是基本内容，是目前研究的焦点，是基本内容，是目前研究的焦点，转录调控是基因调控的核心。转录调控是基因调控的核心。 原核生物的转录真核生物转录相同：要有模板，新链延伸方向相同：要有模板，新链延伸方向5353，碱基，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。的加入严格遵循碱基配对原则。 相异：复制需要引物，转录不需引物。相异：复制需要引物，转录不需引

54、物。 转录时，模板转录时，模板DNADNA的信息全保留的信息全保留，复，复 制时模板信息是半保留。制时模板信息是半保留。 转录时，转录时，RNARNA聚合酶只有聚合酶只有5353聚合作用，无聚合作用，无5353及及3535外切外切活性。活性。 转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。基因表达的终产物：基因表达的终产物：RNA RNA 蛋白质蛋白质 RNA合成的酶学过程合成的酶学过程RNA合成的起始信号和终止信号，即合成的起始信号和终止信号，即DNA分分子上的特定序列。子上的特定序列。DNA正链：与正链：与mRNA序列相同的序列相同的DNA链。链。负链

55、：与正链互补的负链：与正链互补的DNA链。链。转录单位的起点核苷酸为转录单位的起点核苷酸为+1，起点右边为下游，起点右边为下游（转录区），转录起点左侧为上游，用负数表（转录区），转录起点左侧为上游，用负数表示：示：-1，-2，-3 RNA链的转录，起始于链的转录，起始于DNA模板的一个特定位点模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因（真核），也可位。一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。以是多个基因（原核）。基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段基因的转录是有选择性的，

56、细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。转录的起始由转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止上的启动子区控制，转录的终止由由DNA上的终止子控制，转录是通过上的终止子控制，转录是通过DNA指导的指导的RNA聚合酶来实现的。聚合酶来实现的。DNA指导的RNA聚合酶 1960年至1961年，科学家分别从微生物和动物细胞中分离到了DNA指导下的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase）。大肠杆菌的RNA聚合酶全酶的分子量为460kd由5个亚基组成：2，如果没有亚基则称为核心酶(core enzyme)。核心

57、酶只能延长RNA，不能起始，可见亚基对起始和起始序列的识别具有重要作用。此外，在全酶制剂中还带有一个小分子蛋白，称为亚基，其生物学功能不详。每一个大肠杆菌细胞大约含有7000个酶分子。亚亚基基分分子子量量(kd)比比例例功功能能1601507037911121和模板 DNA结合起始和催化部位起始作用未知未知大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的大小与功能底物：底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP） RNA链生长方向：链生长方向：53 不需引物不需引物 需需DNA模板模板 启动子和转录因子 为了研究的方便，我们将转录的起始核苷酸定为1，其5端的序列称为上游序列（upstream sequence)

58、，用1，2表示，其3端序列称为下游序列(down stream sequence)，用+2,+3表示。为了搞清楚起始序列，Pribnow等人用足迹法(foodprint)：即把用限制性内切酶片断和RNA聚合酶共培养，再用DNA酶水解，再把RNA聚合酶保护的DNA进行序列分析，即可以测定出RNA结合DNA的序列(footprint),测定了数十个启动子序列，发现它们在10的位置有共同的序列：TATAATG,于是他称之为Pribnow box。后来发现在-35的位置上还有一个TTGACA的序列(Sextama-box)，是RNA聚合酶的识别序列,又称为RNA聚合酶识别位点。现在 认为：RNA聚合酶

59、在DNA上滑动到-35的位置认出起始序列开始松弛结合，当行走到-10位置便和DNA紧密结合。在起始位点起始转录。 转录过程有几个重要事件发生在启动子上，这些事件主要是由亚基所制导的：1、RNA聚合酶结合到识别位点上，即-35附近的Sextama-box上。2、移动到起始位点，开始和DNA紧密结合，这一点就是Pribnow-box。3、建立一个开放的启动子复合物（open-promoter complex）终止子和终止因子 提供转录停止信号的DNA序列称为终止子(terminator)。协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子称为终止因子(termination factors)。有些终止 子可以

60、被特异性蛋白因子所阻止，称为抗终止因子(antitermination factors)。由于抗终止因子的作用转录酶可以跨过终止位点产生通读(read through)。 大肠杆菌存在两种终止子，一类不依赖因子的终止子和一类依赖因子的终止子。两种类型的终止子请见讲义366页图206。 正如RNA聚合酶识别起始位点需要因子的帮助一样，RNA聚合酶识别终止因子也需要一些特殊的辅助因子，已知nus位点即与终止有关，至少有3个基因位点：nusA、nusB、nusE，其中nusA基因产物的作用研究最多。当RNA聚合酶在亚基的作用下识别出转录起始位点并开始转录之后，因子即脱落，核心酶开始继续转录，当转录到