XXXX年湖北省结核病防治研究所实验室诊断(鲁进)

1、 2013年年8月月 鲁进上传，以供学习鲁进上传，以供学习2v结核分枝杆菌是结核病的致病因子与确诊依据，结核分枝杆菌是结核病的致病因子与确诊依据，结核病实验室诊断就是用直接或间接的方法来证结核病实验室诊断就是用直接或间接的方法来证明患者体内存在结核分枝杆菌。在临床患者样本明患者体内存在结核分枝杆菌。在临床患者样本中寻找结核分枝杆菌也就是实验室检测的主要内中寻找结核分枝杆菌也就是实验室检测的主要内容。理想的诊断技术应该具有快速、特异、敏感、容。理想的诊断技术应该具有快速、特异、敏感、准确简便和价格低廉的特点，这也是结核界近百准确简便和价格低廉的特点，这也是结核界近百年来技术研究的方向。年来技术研

2、究的方向。3v 目前结核病实验室检查主要有：目前结核病实验室检查主要有：v 结核病的细菌学诊断（涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、结核病的细菌学诊断（涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定）分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定）v 结核病的免疫学诊断（皮肤结核菌素试验、结核抗体测定、结核结核病的免疫学诊断（皮肤结核菌素试验、结核抗体测定、结核抗原测定、细胞因子检测）抗原测定、细胞因子检测）v 结核病分子生物学检测（结核病分子生物学检测（DNA探针技术、探针技术、PCR测序、测序、PCR定性定性检测结核分枝杆菌、双重实时荧光检测结核分枝杆菌、双重实

3、时荧光PCR技术和技术和TaqMan探针技探针技术及等温扩增技术），目前分子生物学检测技术发展非常快。术及等温扩增技术），目前分子生物学检测技术发展非常快。v 结核病病理学诊断。结核病病理学诊断。4v根据国家和我省的根据国家和我省的“十二五十二五”结核病防治规划，要结核病防治规划，要求求100的地（市）级结核病实验室具备药物敏感的地（市）级结核病实验室具备药物敏感性试验能力、性试验能力、100的区（县）级实验室具备分枝的区（县）级实验室具备分枝杆菌培养能力，同时根据我省杆菌培养能力，同时根据我省“三位一体三位一体”工作开工作开展的实际情况展的实际情况 ，目前我省各级开展结核病诊断的实，目前我省

4、各级开展结核病诊断的实验室在涂片、培养、药敏实验方面能力还显不足。验室在涂片、培养、药敏实验方面能力还显不足。因此主要从细菌学诊断给大家做些介绍，同时简介因此主要从细菌学诊断给大家做些介绍，同时简介目前我国正在评估和推广应用的新诊断技术。目前我国正在评估和推广应用的新诊断技术。6 每一张玻片都要编号每一张玻片都要编号 涂抹痰标本涂抹痰标本 自然干燥自然干燥 加热固定加热固定7使用铅笔在磨砂面上编号使用铅笔在磨砂面上编号8使用竹木签进行涂抹使用竹木签进行涂抹91011加热固定涂片加热固定涂片12太厚太厚 适宜适宜 太薄太薄13好好脱落脱落好好不均匀不均匀14 适宜适宜太厚太厚太薄太薄15v挑取了

5、痰标本的脓性部分挑取了痰标本的脓性部分v做螺旋状轨迹涂抹均匀做螺旋状轨迹涂抹均匀v 大小约为大小约为 2cm X 1cm v 不要太厚不要太厚v 透过染色前的痰膜可以隐约看到报纸上的透过染色前的痰膜可以隐约看到报纸上的字字16v 初染初染 (碱性复红碱性复红)v 脱色脱色 (盐酸酒精盐酸酒精)v 复染复染 (亚甲兰亚甲兰) 17碱性复红脱色复染18v将涂片排放在染色架上将涂片排放在染色架上v滴加碱性复红染色液，加热出现蒸汽后，保持滴加碱性复红染色液，加热出现蒸汽后，保持5分钟分钟v流水轻缓冲洗流水轻缓冲洗v滴加脱色液，保持滴加脱色液，保持1分钟分钟 v流水轻缓冲洗流水轻缓冲洗v滴加亚甲兰复染液

6、，保持滴加亚甲兰复染液，保持1分钟分钟v流水轻缓冲洗流水轻缓冲洗19将涂片排放在染色架上，注意间隔将涂片排放在染色架上，注意间隔20滴加碱性复红滴加碱性复红21加热加热22流水冲洗流水冲洗23脱色脱色-流水轻缓冲洗流水轻缓冲洗24复染复染25流水洗去复染液流水洗去复染液 26在玻片架上自然干燥在玻片架上自然干燥27 ZN染色步骤 涂涂痰痰膜膜自自然然干干燥燥复复红红加加热热初初染染5 5分分钟钟自自然然干干燥燥镜镜检检流流水水冲冲洗洗美美兰兰复复染染3030秒秒5%5%盐盐酸酸酒酒精精脱脱色色1-31-3分分钟钟流流水水冲冲洗洗流流水水冲冲洗洗28v0.1%金胺金胺“O”染液染色染液染色10分

7、钟，水洗；分钟，水洗；3%的盐酸酒精脱色的盐酸酒精脱色1-2分钟，直至无黄色可见，水分钟，直至无黄色可见，水洗；洗；0.5%高锰酸钾溶液复染高锰酸钾溶液复染1-2分钟，水洗，分钟，水洗，晾干。晾干。v检测用检测用10倍目镜，倍目镜，40倍物镜，不加油。倍物镜，不加油。30单一的抗酸菌单一的抗酸菌31“V”- 字形字形32成簇的抗酸菌33复染太浓造成的影响复染太浓造成的影响34适宜的复染适宜的复染3536v阴性阴性 未发现抗酸菌未发现抗酸菌/ 300 视野视野v报告实际菌落数报告实际菌落数 1-8 条条 /300 视野视野v(1+) 3-9 条条 / 100 视野视野v(2+) 1-9 条条 /

8、 l 0 视野视野v(3+) 1-9 条条 / 每视野每视野v(4+) 达到或超过达到或超过 10 条条 /每视野每视野v报告报告1+至少观察至少观察300视野，视野，2+至少观察至少观察100视野，视野，3+以上至少以上至少50个视野个视野37v阴性阴性 未发现抗酸菌未发现抗酸菌/ 50视野视野v报告实际菌落数报告实际菌落数 1-9条条 /50 视野视野v(1+) 10-49 条条 / 50 视野视野v(2+) 1-9 条条 / 每视野每视野v(3+) 10-99条条 / 每视野每视野v(4+) 达到或超过达到或超过 100条条 /每视野每视野v报告报告2+至少观察至少观察50视野，视野，3

9、+以上至少以上至少20个视野个视野3839v对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约2ml痰标本痰标本置于相应的前处理管中；置于相应的前处理管中；v使用吸管，将与痰标本等体积使用吸管，将与痰标本等体积4% NaOH加入前处理加入前处理管中；管中；v旋紧处理管螺旋盖，接通涡旋振荡器电源，将处理管在旋紧处理管螺旋盖，接通涡旋振荡器电源，将处理管在涡旋振荡器上涡旋震荡涡旋振荡器上涡旋震荡30秒左右；秒左右；v如果以手持拿处理管，持拿方法是以拇指、无名指分别如果以手持拿处理管，持拿方法是以拇指、无名指分别持拿处理管外壁，食指、中指按处理管螺旋盖。持拿处理管外壁，食指

10、、中指按处理管螺旋盖。40v将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室温静置温静置15分钟；分钟；v拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。培养管内壁，将凝固水弃去。v以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，吸取时吸取的以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，吸取时吸取的程度要小于挤压的程度，使吸管前端一段不含液体，程度要小于挤压的程度，使吸管前端一段不含液体，避免液体意外滴落。避免液体意外滴落。41v保

11、持培养基斜面水平或底端略高，均匀接种至酸性罗氏保持培养基斜面水平或底端略高，均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，每支培养基使用接种培养基斜面上，每支培养基使用接种2滴（约滴（约0.1 -0.15 ml），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部；二滴接种到培养基上部；v将用过的吸管置于废液缸内；将用过的吸管置于废液缸内；v旋上培养管螺旋盖，不要太紧；旋上培养管螺旋盖，不要太紧；v轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀的在斜轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀的在斜面上铺开。面上铺开。v培养基置于恒温培养箱内，培养基置于恒温培养箱内，36

12、1孵育；孵育；42 操作操作 振荡匀化振荡匀化静静置置15分钟分钟43 37 37竖直培养竖直培养8 8周周均匀接种均匀接种0.1ml,2支支/标本标本斜面向上，斜面向上，3737水平放置水平放置24小时小时接种和孵育接种和孵育44涡旋振荡涡旋振荡1-21-2分钟分钟痰标本中加入痰标本中加入1-21-2倍体积倍体积4%NaOH4%NaOH分别接种分别接种0.1ml0.1ml前处理液至前处理液至2 2只培养基斜面只培养基斜面接种后接种后3 3天、天、7 7天天观察，此后每周观察，此后每周观察一次观察一次置置3737温温箱培养箱培养有菌落生长需经有菌落生长需经抗酸染色确认，抗酸染色确认，至第至第8

13、 8周无菌落周无菌落生长报告阴性生长报告阴性室温静置室温静置1515分钟分钟4 43 32 25 56 67 71 145v 接种后第接种后第3和和7日观察培养情况，此后每周观察一次，直日观察培养情况，此后每周观察一次，直至第八周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察至第八周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。结果。v 无菌落生长无菌落生长 报告培养阴性报告培养阴性v 菌落生长不及斜面面积菌落生长不及斜面面积1/4时时 报告实际菌落数报告实际菌落数v 菌落占斜面面积菌落占斜面面积 1/4 报告报告(1+)v 菌落占斜面面积菌落占斜面面积1/2 报告报告(2+)v 菌落占斜面面积

14、菌落占斜面面积3/4 报告报告(3+)v 菌落布满培养基斜面菌落布满培养基斜面 报告报告(4+)46v 以药物敏感性测试为目的（包括耐药性诊断和耐药监测等），不以药物敏感性测试为目的（包括耐药性诊断和耐药监测等），不需要对培养物进行涂片检查，只需将培养物送至进行药物敏感性需要对培养物进行涂片检查，只需将培养物送至进行药物敏感性测试的实验室，并附培养物生长情况的报告单。测试的实验室，并附培养物生长情况的报告单。v 以培养作为诊断或评价疗效为目的，需要对培养物进行涂片显微以培养作为诊断或评价疗效为目的，需要对培养物进行涂片显微镜检查、鉴定，根据涂片和鉴定结果进行报告。镜检查、鉴定，根据涂片和鉴定结

15、果进行报告。v 培养物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形态、生长培养物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形态、生长时间，报告：罗氏培养抗酸菌阳性时间，报告：罗氏培养抗酸菌阳性v 经菌种初步鉴定，证实为结核分枝杆菌复合群后，报告：罗氏培经菌种初步鉴定，证实为结核分枝杆菌复合群后，报告：罗氏培养结核菌阳性养结核菌阳性 47v 1、幼稚菌落比较小，表面光滑、幼稚菌落比较小，表面光滑而有光泽呈黄色；成熟典型菌一而有光泽呈黄色；成熟典型菌一般为中等大小或较大，干燥粗糙，般为中等大小或较大，干燥粗糙，易碎，呈奶酪色，白色或橘黄色，易碎，呈奶酪色，白色或橘黄色，不透明凸起菌落。不透明凸起菌落。

16、v 2、不典型菌落为细小、园形、不典型菌落为细小、园形、湿润、易乳化、呈黄红色，一般湿润、易乳化、呈黄红色，一般7-10天内就成熟，常为非典型天内就成熟，常为非典型抗酸杆菌或非致病菌。抗酸杆菌或非致病菌。4849v 如果发现培养基污染，按污染面积报告如果发现培养基污染，按污染面积报告v 污染菌有明显界限，且不超过斜面面积污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/4 报告报告(C1+)v 污染菌有明显界限，且不超过斜面面积污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/2 报告报告(C2+)v 污染菌有明显界限，且不超过斜面面积污染菌有明显界限，且不超过斜面面积3/4 报告报告(C3+)v 污染菌没有明显界限

17、或布满培养基斜面污染菌没有明显界限或布满培养基斜面 报告报告(C4+) 50v 留取标本后，尽可能立即进行培养。如果不能立即处理，应留取标本后，尽可能立即进行培养。如果不能立即处理，应冷藏；冷藏；v 将氢氧化钠分装成若干小瓶（小包装），每次使用新的氢氧化将氢氧化钠分装成若干小瓶（小包装），每次使用新的氢氧化钠；钠；v 如果只有一台生物安全柜，避免同时进行涂片和培养操作；如果只有一台生物安全柜，避免同时进行涂片和培养操作；v 在同一批处理的痰标本中，优先处理涂片阴性的标本，其次处在同一批处理的痰标本中，优先处理涂片阴性的标本，其次处理阳性级别低的标本，最后处理涂片阳性级别高的标本理阳性级别低的标

18、本，最后处理涂片阳性级别高的标本v 打开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时避免剧打开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时避免剧烈震荡标本，震荡后静置几分钟，然后再打开盖子烈震荡标本，震荡后静置几分钟，然后再打开盖子51v处理标本时，尽可能随时盖上容器盖子，避免在生处理标本时，尽可能随时盖上容器盖子，避免在生物安全柜内敞开所有的标本容器物安全柜内敞开所有的标本容器v用过的无菌吸管应置于废液缸中；用过的无菌吸管应置于废液缸中；v正确标记培养管避免标本之间混淆；正确标记培养管避免标本之间混淆；v控制前处理去污染的接触时间，从向标本中加入氢控制前处理去污染的接触时间，从向标本中加入氢

19、氧化钠到接种时间不能超过氧化钠到接种时间不能超过20分钟，为此，当标本分钟，为此，当标本数量较多时，应分批处理，每批标本数量不超过数量较多时，应分批处理，每批标本数量不超过6份为宜；份为宜； 52v应将培养结果及时反馈给临床医生。应将培养结果及时反馈给临床医生。7天以内的结果天以内的结果观察中如果发现污染，应告知病人及时收集另一份标观察中如果发现污染，应告知病人及时收集另一份标本；如果发现快速生长分枝杆菌（本；如果发现快速生长分枝杆菌（7天内长出的菌天内长出的菌落）。立即报告结果并要求再收集另一份痰标本。落）。立即报告结果并要求再收集另一份痰标本。v结核菌可能在结核菌可能在3-4周内生长。发现

20、菌落并鉴定后立即周内生长。发现菌落并鉴定后立即报告结果。报告阴性培养结果时应孵育满报告结果。报告阴性培养结果时应孵育满8周。周。v登记内容应包括：菌落初生长的日期以及阳性培养物登记内容应包括：菌落初生长的日期以及阳性培养物的菌落特征的菌落特征;污染结果应随时检出并报告。污染结果应随时检出并报告。53v涂阳培阴率涂阳培阴率=培养阴性的病例总数培养阴性的病例总数/涂片检查阳涂片检查阳性的病例总数性的病例总数*100%v涂阳培阴率应涂阳培阴率应10%v污染率污染率=污染的培养管数量污染的培养管数量/培养管总数培养管总数*100%v污染率应污染率应5%54可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度） 标

21、本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。标本选择不当选择标本中脓样、干酪样可疑部分过处理（时间、浓度)4NaOH，12倍体积，20分钟接种量太小每管接种0.1毫升温箱温度不当温箱内置温度计，每日监测温度。？55可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。前处理不充分4，12倍，充分混旋，20分钟。材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。操作不当培训，预培养，严格按操作规程操作。培养基因素统一供应，4C直立保存，1个月内使用56v 目的：治疗，监测，诊断耐药目的：治疗，监测，诊断耐药v 主要就是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗主要就是诊断

22、耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。药水平。57v 比例法比例法 Canetti , 1963v 临界药物浓度（单和多药物浓度）临界药物浓度（单和多药物浓度）v 临界菌群比耐药菌群数临界菌群比耐药菌群数/全菌群数全菌群数v 1% 、10% v 绝对浓度法绝对浓度法 Meisnner， 1963v 临界药物浓度（单或多药物浓度）临界药物浓度（单或多药物浓度）v 临界药物菌落数（临界药物菌落数（10、20菌落）菌落）v 比率法比率法 Mitchson， 1963v RR= MIC被检菌被检菌/M

23、ICH37Rv：58v含药培养基的制备含药培养基的制备v菌液制备和稀释菌液制备和稀释v接种接种v培养培养v报告结果报告结果59WHO 推荐的推荐的DST培养基药物浓度培养基药物浓度 ( 2007)60v 实验前物品准备实验前物品准备v 所有实验用品必须无菌所有实验用品必须无菌v 所有用品一次性拿入实验室，不要在实验过程中反复进所有用品一次性拿入实验室，不要在实验过程中反复进出实验室出实验室61v 一、临床标本初分离的菌株，若具备以下特点，可直接一、临床标本初分离的菌株，若具备以下特点，可直接用于药敏试验：用于药敏试验： 1、出现肉眼可见菌落后、出现肉眼可见菌落后12周的新鲜周的新鲜菌落。菌落。

24、2、没有其他污染菌共存。、没有其他污染菌共存。3、涂片确认为抗酸菌、涂片确认为抗酸菌v 二、以下情况需要二次传代后才能进行药敏试验：二、以下情况需要二次传代后才能进行药敏试验：1、 固体培养基上生长老化的菌落。固体培养基上生长老化的菌落。2、固体培养基上部分污、固体培养基上部分污染的菌落。染的菌落。62v 实验人员的安全防护：分枝杆菌药敏试验是对高致病性实验人员的安全防护：分枝杆菌药敏试验是对高致病性病原微生物的纯分离培养物进行操作，实验室实验人员病原微生物的纯分离培养物进行操作，实验室实验人员进入药敏试验区须穿防护服、鞋套，实验中须戴手套、进入药敏试验区须穿防护服、鞋套，实验中须戴手套、帽子

25、、帽子、N95口罩。口罩。63v 准备磨菌瓶或磨菌管：准备磨菌瓶或磨菌管：v 磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个个直径直径3mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。的玻璃珠，高压灭菌后待用。v 磨菌管为底部磨砂的玻璃管，带有与之匹配的磨砂玻磨菌管为底部磨砂的玻璃管，带有与之匹配的磨砂玻璃棰（磨菌棒），分别高压后方可可使用。璃棰（磨菌棒），分别高压后方可可使用。64v 磨菌瓶法：磨菌瓶法：v 在磨菌瓶中加入在磨菌瓶中加入12滴滴10%吐温吐温-80，用火焰消毒的接，用火焰消毒的接种环刮取种环刮取2-3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮周的新鲜菌

26、落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋0.5-1分钟。分钟。加入少许灭菌的加入少许灭菌的PBS或生理盐水。或生理盐水。v 将悬浊液转移至比浊管中，加生理盐水或将悬浊液转移至比浊管中，加生理盐水或PBS其浊度与标其浊度与标准麦氏比浊管（准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即得到）一致，即得到1mg/ml的菌液。的菌液。65v 磨菌管法磨菌管法v 向磨菌管中加入向磨菌管中加入1滴滴10%吐温吐温-80，用火焰消毒的接种，用火焰消毒的接种环刮取环刮取2-3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌器底部，插入周的新鲜菌落，放

27、入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，磨菌棒捻动，使呈乳酪样，v 加入少许灭菌加入少许灭菌PBS缓冲液或生理盐水，静止片刻，缓冲液或生理盐水，静止片刻，v 吸适量（吸适量（1-2ml）至比浊管中，加入生理盐水直至其浊）至比浊管中，加入生理盐水直至其浊度与标准麦氏比浊管（度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即）一致，即为为1mg/ml的菌液。的菌液。66取菌 磨菌67v每株菌事先准备好每株菌事先准备好2个稀释管，然后用个稀释管，然后用22 SWG标准接种环或微量吸管吸取比浊好的菌液，无菌标准接种环或微量吸管吸取比浊好的菌液，无菌操作逐步稀释至操作逐步稀释至10-2m

28、g/ml和和10-4mg/ml。v 22 SWG标准接种环：金属丝直径标准接种环：金属丝直径0.7mm，接种环内径接种环内径3mm，1满环移液满环移液0.01ml。68v用用22 SWG标准接种环分别沾取标准接种环分别沾取1环环 （即（即0.01ml ）10-2mg/ml和和 10-4mg/ml的菌液，的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为接种菌量为10-4mg和和10-6mg。v接种后的培养基置于接种后的培养基置于37培养，至四周后报告结培养，至

29、四周后报告结果。果。6970v 按以下方式记录菌落生长情况：按以下方式记录菌落生长情况：v 少于少于50个菌落：个菌落： 实际菌落数实际菌落数v 50-100个菌落：个菌落： 1+v 100-200个菌落：个菌落： 2+v 大部分融合（大部分融合（200-500个菌落）：个菌落）： 3+v 融合（大于融合（大于500个菌落）：个菌落）： 4+v 4周后观察结果，如果生长不良，可适当延长但不能超过周后观察结果，如果生长不良，可适当延长但不能超过6周报告结果周报告结果. （耐药菌长的慢，药效丧失）（耐药菌长的慢，药效丧失）71v 计算耐药百分比：计算耐药百分比：v 含药培养基上生长的菌落数含药培养

30、基上生长的菌落数v 耐药百分比耐药百分比= - 100%v 对照培养基上生长的菌落数对照培养基上生长的菌落数v 若耐药百分比大于或等于若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结，则认为受试菌对该抗结核药耐药。核药耐药。v 72菌菌浓浓度度药药物物74757677v 若高稀释度菌液（若高稀释度菌液（10-4mg/ml）在对照培养基上生长）在对照培养基上生长的菌落数少于的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。试验。v 每批试验以结核分枝杆菌参考菌株（每批试验以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv敏感株）敏感株） 检测含药培养基的质量。检测含药培养

31、基的质量。78v 培养基制备药物效价、保存与使用期限培养基制备药物效价、保存与使用期限v 选择新鲜、生长旺盛的菌落进行药敏试验，生长不良或选择新鲜、生长旺盛的菌落进行药敏试验，生长不良或陈旧菌株应传代后再进行试验陈旧菌株应传代后再进行试验v 比浊、菌液稀释应力求精确，以保证接种菌量的准确。比浊、菌液稀释应力求精确，以保证接种菌量的准确。v 下列操作应严格按技术规范进行，防止产生气溶胶：挑下列操作应严格按技术规范进行，防止产生气溶胶：挑取菌落、磨菌、菌液稀释和接种、烧灼接种环。取菌落、磨菌、菌液稀释和接种、烧灼接种环。v 实验后按要求处理废弃物和实验物品。实验后按要求处理废弃物和实验物品。79对

32、照培养基对照培养基含药培养基含药培养基药物储存液药物储存液混合、摇匀混合、摇匀基础液改良L-J100ml1ml磨菌磨菌分装分装凝固凝固分装分装凝固凝固1mg/ml菌悬液菌悬液1010-4 -4 mg/ml 1010-2 -2 mg/ml 100倍稀释倍稀释100倍稀释倍稀释接种接种0.01ml接种接种0.01ml2-3周周新鲜菌落新鲜菌落冻存冻存80v 根据分支杆菌在一些特定培养基上是否生长的特性，将其根据分支杆菌在一些特定培养基上是否生长的特性，将其初步鉴定为人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌和非典初步鉴定为人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌和非典型分支杆菌。型分支杆菌。v 主要的培养基为主

33、要的培养基为PNB（对硝基苯甲酸）、（对硝基苯甲酸）、TCH（噻吩（噻吩-2-羟酸肼）培养基羟酸肼）培养基v 接种方法：用接种方法：用22 SWG标准接种环沾取标准接种环沾取1环环 10-1mg/ml的菌液（即的菌液（即0.01ml ），用划线法均匀接种至），用划线法均匀接种至PNB、TCH培养基表面，每管最终接种菌量为培养基表面，每管最终接种菌量为10-3mg/管。管。v 接种后的培养基置于接种后的培养基置于37培养，至四周后报告结果。培养，至四周后报告结果。8182卫生部卫生部-盖茨基金会项目盖茨基金会项目83卫生部卫生部-梅里埃基金会项目梅里埃基金会项目84实验方法医院数量MIGT 96

34、0液体培养和固体培养的比较5卫生部卫生部-碧迪公司项目碧迪公司项目8586v发光二极管发光二极管（ （LEDLED） ）荧光荧光显微镜显微镜 光源寿命光源寿命长长（ （30,000h30,000h） ） 不不需要预热需要预热 不需要不需要暗室暗室 可用现有的显微镜可用现有的显微镜 可使用可使用电池电源电池电源v 与与通常通常荧光显微镜的荧光显微镜的判定判定一致率一致率98.0%98.0%（ （n=1,326/n=1,326/内内部部资料资料） ）Fraen FluoLED module87v Z-N染色镜检结果染色镜检结果v LED镜检结果镜检结果88v初诊患者初诊患者v LED涂阳患者检出率

35、为涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高，前者较后者提高2.5个百分点个百分点（P=0.000）v随访患者随访患者v LED和明场显微镜的检出率分别为和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和和2.83%（71/2509)，提高，提高4.26个百分点（个百分点（P=0.000）89v读片时间读片时间v LED 读片时间读片时间120.0338.88秒，明场显微镜秒，明场显微镜206.3175.86秒（秒（p=0.00）v使用接受度调查使用接受度调

36、查v 对于进一步推广建议，大多数对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，认为应进一步推广，但其中有但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使用人认为应在日工作量大的实验室优先使用90v可检测是否感染结核杆菌可检测是否感染结核杆菌v可同时检测患者是否对利福平和异烟肼耐药可同时检测患者是否对利福平和异烟肼耐药v约五小时内即可得到检测结果约五小时内即可得到检测结果91 检测步骤v DNA提取：提取：11.5hv PCR扩增：扩增：2.53hv 探针杂交：探针杂交：22.5hv 结果判读：结果判读：0.5h92v利福平利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特异烟肼耐药性的产生与结核分

37、枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。定基因某些位点的突变相关。抗结核药基因基因功能利福平rpoB编码DNA依赖RNA聚合酶，参与mRNA转录过程异烟肼katG编码过氧化氢-过氧化物酶，参与INH体内的转化inhA编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的enoyl-ACP还原酶，参与脂酸的合成93利福平线性探针传统药敏合计一致率灵敏度特异性PPV阳性预测值NPV阴性预测值耐药敏感合计耐药1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感4511271172合计1801168134894异烟肼线性探针传统药敏总计一致率灵敏度特异性PPVNPV耐药敏感合计耐药1493017993

38、.2%71.0%97.4%83.2%94.8%敏感6111081169合计2101138134895MDR线性探针传统合计一致率灵敏度特异性PPVNPVMDR非-MDR合计MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8%96.8%非-MDR4012011241合计1191229134896激光共焦扫描仪软件判读结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪n 通 量：两个一线抗结核药n 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍）n 灵敏度：103 CFU/反应n 特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰

39、样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）96获国家医疗器械证书和欧盟CE认证97基因芯片基因芯片v 基因芯片是指采用光导原位基因芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高的强度进行快速、并行、

40、高效地检测分析，从而判断样效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。品中靶分子的数量。98杂交反应杂交清洗清洗干燥扫描检测数据分析检测分析PCR扩增DNA 提取样品制备99100产品指标基因芯片线性探针注册证书SFDA、CESFDA、CE产地中国德国用途从涂片阳性痰标本或培养物中检测对利福平和异烟肼的耐药性从涂片阳性痰标本或培养物中检测分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性检测原理耐药相关基因的突变耐药相关基因的突变（参考国际文献）检测方法反向杂交（斑点）反向杂交（slot 缝隙）需要仪器核酸提取仪、基因扩增仪、芯片杂交仪、芯片洗干仪和扫描仪超声水浴、基因扩增仪、杂交仪试剂储藏4 和-204 和-2

41、0检测指标 M.tb + 16 NTM种/群 M.tb + 13 NTM种/群 可扩展性 强 弱 内部质控 5种 3种灵敏度 102-103菌/ml JCM, in revision 102-103菌/ml JCM, 2002 符合率 三家医院，1724例，测序符合率100% 分离株(157株)JCM 2008,(197株)JCM 2006,(219株)CMI 2006。符合率分别为100%,98.9%和88% 探针重复5次 1次 检测重复性 10次重复，结果均正确 无相关资料 其他样本 痰标本、分离株痰标本、分离株操作流程 自动化高（杂交-清洗-扫描），省力，通量高，重复性好 自动化低（杂交

42、）， 费力，通量低，重复性稍差 结果判读 仪器扫描，软件自动判读 杂交显示条带需黏贴比对，肉眼或自动判读，。 成本 相当（根据两家的市场价格和在疾病预防控制体系中应用的承诺价格 ）101v可同时检测患者是否感染结核可同时检测患者是否感染结核v对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性v两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备极其两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备极其简单简单102PCR LAMP需要使用需要使用PCR扩增仪扩增仪 针对针对基因基因设计设计的特异性的两条引物的特异性的两条引物 扩增效率扩增效率:107不需要使用不需要使用PCR扩增仪扩增仪

43、多多对对引物保引物保证证了了扩扩增的特异性增的特异性 扩扩增效率增效率:1010103抽提基因组DNA 扩增管去除杂质将纯净DNA转入扩增管 痰血液咽试子标本类型样品处理在几分钟内就可以完成104v可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药v对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性v两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单105基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测Xpert TM MTB/Rif技术平台技术平台 利福平的耐药性分析 喹诺酮类药物耐药性 HIV 病毒载量分析自动化的标本处理和检测，可以在自动化的标本处理和检测，可以在2小小时内出结果时内出结果h106原理：原理：v分枝杆菌抗原致敏的分枝杆菌抗原致敏的T细胞体外再次接触分枝杆菌抗原时细胞体外再次接触分枝杆菌抗原时会产生会产生IFN- ；v大量产生的大量产