western实验步骤与注意事项

1、葵花宝典致亲爱的师弟师妹:本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写、来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住, 以及实验室里有什么仪器！ ！ ！二、关于实验部分1、组织蛋白提取：方法一：(1) 4 C下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液， 剪刀剪碎，匀质器6000,循环六次， 每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后 14000转，20min , 4C(2) 跑western之前，需测BCA以保证每个组分上样的蛋白总质量一样(此处为定 量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA)注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝

2、荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行(包括管底小尖尖)，且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。方法二：(1) 取冰(东边实验室，最后面有制冰机)(2) 将软骨从-80 C冰箱取出，置于冰面上解冻(3) 去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内,(4) 转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨(5) 浆糊状，立即转入 EP管中，(6) 细胞裂解液，2、western blotting(1 )抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称，最好是英文全称，许多客户只说简称，要知道不同的抗体其简 称有可能会一样的有中文最好也提供一下2. Rea

3、ctivity，即反应性，也就是实验用于什么特种，是人，大鼠还是小鼠等3. Host，宿主，就是抗体来源，这个主要和二抗有关系。一抗来源必须要和二抗搭配，且不能和样本来源相同。比如，二抗是羊抗小鼠，一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有 二抗，再买一抗，受限制得很，其实应该先订一抗，再买二抗，毕竟一抗贵，为了将就一个100元左右的二抗，而把几千元的一抗的订购弄得很复杂，真是不划算.所以，不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate，即缀合物或标记物，如是不是需要 FITC标记，HRP标记等情况，也最好说明5. Applications，就是应用.你买这个抗体用于做什么实验，是IHC还是WB，

4、这点一定要说要知道，抗体开发出来，不是什么实验都能用或都会效果好，抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的，没有写的不是说一定不能做，也可能可以做，但没有验证，厂家不会乱 说的，也是科学，负责的态度.例如，你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化，如果买不到抗体明确说可以做，你要用就得冒风险，好在现在抗体厂家众多一般都找得到了(2) 3 -actin (内参蛋白)分子质量为43KD,因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一 致，内参也叫看家基因， 在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有3 -ACTIN, GAPDH等。其作用有二：(1 )、是看提取蛋白质量的好

5、坏。如 果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等 步骤没有问题，是目标蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。(2)、是比较客观的说明目标蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。 不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照， 比较不同标本之间的表达情况。因此，最好测一下蛋白浓度再上样，这样好点。当然也看你的实验室是定性还是定量了，定性的话，我觉得可以不用测浓度；要是准备定量，还是尽量保证上样量一 致吧。(3) 5倍的上样缓冲液：用样品稀释上样缓冲液至1倍，煮沸5min，离心2min (使粘壁蛋 白脱落至底部)，可以放

6、于-20 C隔夜保存(4) 清洗工具：玻璃板，盖玻片，大烧杯和小烧杯，梳子，铸造支架，(5) 根据试剂盒配分离胶。AP (10%过硫酸铵)和TEMED最后加，先混匀之前的溶液(6) 沿着玻璃槽边，注胶，不要有气泡，用水封胶，30mi n(7 )配浓缩胶，同(5)SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物， 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。过硫酸铵(AP):提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。(8) 倒掉水，用滤纸片

7、吸干，注胶，插上梳子，避免有气泡，30mi n(9) 安装至电泳槽，拔下梳子，加入电泳缓冲液(需要自己配，可查百度知道配方)，没过 玻璃板(10) 上样1.5 mm上样量最多可为35微升，0.75mm上样量最多为20微升 红色为正极，黑色为负极。80v 30min, 上样线压平后，120V 2h1.5h 或 200V 1h电泳缓冲液配方：【爼分浓度】配制不冋弹杞斫嘉刍戌井词偉积(ML)或乐号g)woomiboomiD .125M Tris15.1g1 笳話 giycine()94 0g0 5%(W/V)3DSsog【配制方法】馬取 低角T® 94甘氢酸(glydrie) . 5 0y

8、SDS,用BOOM姿摆水或去离子水法網 充丹搅拌溶 解/定容至400卯11空湛保冇.得0 125mol/L Tris-1,25rriol；L甘謎电极餘口港.临用前稀璨5倍.（11）拆开电泳槽，将凝胶放在ph=9.15缓冲溶液。（12 ）裁剪略大于凝胶的滤纸片六张，两张滤纸片置于PH=9.15缓冲溶液中，其余放于ph=5.19缓冲溶液中。（13） 裁剪PVDF膜一张，置于甲醇溶液1min （活化PVDF,使膜表面带正电荷），再置于蒸 馏水2min，摇床一会，再置于 PH=9.15缓冲溶液中（14） 转膜：先铺两张滤纸（ph=9.15），再铺凝胶（靠近负极），再铺PVDF膜（靠近正极）， 再铺四张

9、滤纸（ph=5.19），记得润湿电转仪的上下面板Buffer 1 （ PH=9.4）配方：Tris 3.03g甘氨酸5.25g甲醇200ml去离子水 1L（15 ）膜的面积*4.5=转膜电压，40min200mA，20min ?100mA目标蛋白多大，就多久 转膜效果不太好，时间不够（16）最好用TBST清洗转膜液，再用5%脱脂牛奶（5g脱脂牛奶粉末，100ml PBST（ 500ml1*PBS + 1ml Tween-20，调 pH 7.0-7.2，即为 PBST ）中浸泡 PVDF膜，1 小时10*TBS tris 12.1gNaCI 88g去离子水 1L浓盐酸调PH至8.0如果配置100

10、0ml的TBST先称量NaCI 40g，倒入烧杯中，加 DDW蒸馏水400ml,再称量NaCI 47.6g，倒入 刚才的那个烧杯中，：由于NaCI的量太多，一次称量不方便，所以分两次称量，且易于溶解）。 往烧杯中加入 Tris HCl缓冲液100ml，最后加吐温20， 5ml,转入1000ml容量瓶中，在定 容，转移即可。（17） 加一抗（5%脱脂牛奶稀释）孵育过夜，4C（18）PBST洗三次，每次 5min（19）加二抗（5%脱脂牛奶稀释）摇床，室温孵育，一小时（夏天半个小时）（20）PBST洗四次，每次 5min（20）显色（全称避光操作）:配制ECL溶液，1.5ml左右（一张PVDF膜），显色2min （21 ）凝胶成像仪分析2、细胞蛋白：可直接加入蛋白提取液，浸泡30min3、固绿-番红O染色：固绿染色剂极易上色，20s即可，无论你购买的哪个牌子。番红0染色剂极难上色，染色时间为25min （索莱宝），效果仍不太理想。番红O染色剂，两个小时，不理想（染色过程中，切勿放在通风橱中， 染色