生化技术：11蛋白质(酶、抗体)标记1

1、第十一章第十一章 标标 记记标记的概念标记的概念 指以共价键的方式将放射性元素指以共价键的方式将放射性元素（如（如3H、14C、32P、35S、125I）或非放射性物质或非放射性物质（如地高（如地高辛、生物素、酶、荧光素）辛、生物素、酶、荧光素）结合到某些生命物结合到某些生命物质质（如（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗原及、寡核苷酸、抗体、抗原及某些小分子物质）某些小分子物质）上的过程上的过程 标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质的定性、定量的定性、定量 由示踪物和被标记物构

2、成的复合物称为探由示踪物和被标记物构成的复合物称为探针或某物的标记物针或某物的标记物第一节第一节 核核 酸酸 标标 记记 核酸标记是指能与核酸标记是指能与特定核酸序列特定核酸序列（靶序列）发生（靶序列）发生特特异性互补异性互补（杂交），并（杂交），并含示踪物含示踪物的已知核酸片段（的已知核酸片段（DNA或或RNA）一、标记物的制备及类型一、标记物的制备及类型 20C，70Y磷酸化法磷酸化法切口平移法切口平移法 广泛用于分子克隆过程；广泛用于分子克隆过程； 缺点：缺点：只能在核酸的只能在核酸的5端端引进一个放射性原子，会限制探针的比活度引进一个放射性原子，会限制探针的比活度探针含有模板探针含有模

3、板DNA双链序列片段，在某些情况下，探针的互双链序列片段，在某些情况下，探针的互补链会竞争靶补链会竞争靶DNA与探针的结合与探针的结合 20C，80Y中期中期体外转录体外转录RNA探针法探针法 此法合成效率高，不需分离模板此法合成效率高，不需分离模板DNA，但但 应避免应避免RNase污染污染(一一)制备方法制备方法(二二)核酸标记类型核酸标记类型(同位素同位素)核素标记核素标记 通常采用的同位素有通常采用的同位素有3232P P、3333P P、3535S S，其，其中中3232P P活性强，信号比较好活性强，信号比较好 放射性探针与固相载体上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂放射性探针与固相载体

4、上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂交的探针，再通过交的探针，再通过X-X-射线衍射和放射自显影检测分析结果射线衍射和放射自显影检测分析结果（但此法须在特殊实验室进行，防止同位素伤人）（但此法须在特殊实验室进行，防止同位素伤人）非同位素标记非同位素标记 以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）二、非核素标记二、非核素标记 生物素、地高辛生物素、地高辛等非放射性示踪物都很容

5、易掺入到等非放射性示踪物都很容易掺入到DNA或或RNA中制成核酸探针。其信号可采用荧光染料、中制成核酸探针。其信号可采用荧光染料、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶直接与生物素偶联，或碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶直接与生物素偶联，或用荧光染料、碱性磷酸酶与抗地高辛抗体偶联进行检用荧光染料、碱性磷酸酶与抗地高辛抗体偶联进行检测测 此法此法标记量足标记量足（一次反应可标记数（一次反应可标记数mg），），稳定性稳定性好好（有效期可达（有效期可达2年）年）（一）地高辛（一）地高辛（DIG）1.双链双链DNA探针标记探针标记随机引物介导法随机引物介导法随机引物：不均一的寡核苷酸混合物（随机引物：不均一的寡核苷酸混

6、合物（612核苷酸单链核苷酸单链DNA）模板：单链模板：单链DNA酶：酶：DNA-pol（klenow片段）片段）合成原料：合成原料： dNTP混合物混合物标记物：标记物：Dig-dUTP其他试剂其他试剂 随机引物介导法是将线性随机引物介导法是将线性DNA模板上模板上多处多处与随机引物与随机引物杂交，在杂交，在DNA-pol的的 催化作用下，新链中掺入催化作用下，新链中掺入DIG-dUTP,DIG-dUTP,从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度）从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度） 试剂及操作（课本）试剂及操作（课本）切口平移法切口平移法原理：原理：当双链当双链DNA分子的一条链有切口时，分

7、子的一条链有切口时，E.coli-DNA-pol可将核苷酸残基（如可将核苷酸残基（如Dig-11-dUTP）加到切口处的）加到切口处的3-OH端；又由于该酶具有端；又由于该酶具有53外切酶活性外切酶活性，所以它可从，所以它可从切口的切口的5端除去核苷酸。端除去核苷酸。5端除去和端除去和3端加入核苷酸端加入核苷酸同时进同时进行，导致切口沿着行，导致切口沿着DNA模板链移动模板链移动2.2.单链单链DNADNA探针制备探针制备单链单链DNA探针的优点探针的优点 不存在互补双链，避免了不存在互补双链，避免了DNA双链在重新复性时形成双链在重新复性时形成无效杂交体的可能性无效杂交体的可能性方法方法 合

8、成可克隆于噬菌粒或合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌体载体上的噬菌体载体上的DNA片段，片段，并以其作为模板合成与其互补的探针（并以其作为模板合成与其互补的探针（为为DNA）将克隆于特定载体（带有可被噬菌体依赖于将克隆于特定载体（带有可被噬菌体依赖于DNA的的RNA-pol识别的启动子）上的靶序列转录成识别的启动子）上的靶序列转录成RNA探针探针；再在反转录酶的催化作用下制备再在反转录酶的催化作用下制备cDNA探针探针 方法方法需分离探针和未标记的核酸，而方法需分离探针和未标记的核酸，而方法只需只需用不含用不含RNase的的DNase降解即可；故克隆降解即可；故克隆DNA片段的片段的体外转录法体外

9、转录法是合成单链是合成单链DNA探针的较好方法探针的较好方法3.PCR合成合成DNA探针探针 第一次循环之前于第一次循环之前于95变性变性7min，随后每次循环的条，随后每次循环的条件是：件是： 95变性变性45s，60退火退火1min,72 延伸延伸2min（一（一个循环）个循环） 用用PCR法制备的法制备的DIG探针探针灵敏度高灵敏度高（即使含有很少量的（即使含有很少量的副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前，副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前，要用凝胶电泳纯化探针）要用凝胶电泳纯化探针） ，数量大数量大4.寡核苷酸探针的制备寡核苷酸探针的制备 用用DIG-11-d

10、dUTP制备寡核苷酸探针，制备出来制备寡核苷酸探针，制备出来的探针有的探针有3端端-、5端端-寡核苷酸标记和寡核苷酸标记和3-端尾部寡端尾部寡核苷酸标记之分核苷酸标记之分（1）3端端-寡核苷酸探针寡核苷酸探针（2）3-端尾部寡核苷酸探针端尾部寡核苷酸探针 在在寡核苷酸寡核苷酸3-端加上端加上10100个碱基的尾巴。可提高个碱基的尾巴。可提高探针的灵敏度探针的灵敏度 在标记过程中，末端转移酶可将在标记过程中，末端转移酶可将DIG-11-dUTP加到寡加到寡核苷酸的核苷酸的3-尾端尾端 但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以在杂交之前，通过一竞

11、争序列（如在杂交之前，通过一竞争序列（如polyA序列等）序列等）“预杂预杂交交”，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如P201“b”）（3 3）55端端- -寡核苷酸探针寡核苷酸探针 在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷酸盐法，使酸盐法，使5端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷酸与酸与DIG反应制成标记于反应制成标记于5端的寡核苷酸探针端的寡核苷酸探针5.RNA探针的制备探针的制备 采用体外转录法制备采用体外转录法制备先先克隆克隆合适的模板合适

12、的模板DNA到相应的转录载体（如噬菌体）到相应的转录载体（如噬菌体）将得到的重组将得到的重组DNA线性化线性化RNA-pol催化核苷三磷酸在强启动子下游固定位点开始催化核苷三磷酸在强启动子下游固定位点开始转转录录，并将修饰的核苷酸（如，并将修饰的核苷酸（如DIG-UTP）掺入到）掺入到RNA链中，从链中，从而获得具有一定长度和较高活性的而获得具有一定长度和较高活性的RNA探针（每探针（每2025个核个核苷酸可结合一个苷酸可结合一个DIG-11-UTP）（二）生物素（二）生物素 用生物素标记的探针与靶核酸杂交后，探针上的生物用生物素标记的探针与靶核酸杂交后，探针上的生物素能与链霉菌亲和素（或称链

13、霉菌白蛋白）素能与链霉菌亲和素（或称链霉菌白蛋白）- 酶直接结合，酶直接结合，亲和素与生物素的结合力强（结合常数亲和素与生物素的结合力强（结合常数 ）；这类）；这类蛋白质有蛋白质有4个结合生物素的位点，所以它既可与酶标记的个结合生物素的位点，所以它既可与酶标记的生物素结合，又可以与探针中的生物素结合生物素结合，又可以与探针中的生物素结合1510aK1.切口平移法制备生物素酰化的探针切口平移法制备生物素酰化的探针 此法采用生物素此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每制备探针，每1kbDNA可掺可掺入约入约50个生物素分子个生物素分子2.随机引物介导法制备生物素酰化探针随机引物介导法制备生物素

14、酰化探针（三）两种新标记法（三）两种新标记法扫若仑标记和分子灯塔探针扫若仑标记和分子灯塔探针1.扫若仑标记扫若仑标记 扫若仑（扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有）是一种天然的三环化合物，其带有胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可达达fg级别）级别） 扫若仑标记为非酶促反应，是用波长扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320400nm的紫外的紫外光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面光照射，引起光循环反应，使带胺基

15、的扫若仑以三环平面形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和和RNA时，共价键结合的位置分别在时，共价键结合的位置分别在dT和和U处；探针中扫若处；探针中扫若仑衍生物的含量与核酸中胸苷（仑衍生物的含量与核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（）或尿苷（U）的含量）的含量成正比关系成正比关系2.分子灯塔探针分子灯塔探针概念概念 用新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸用新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸的核酸探针的核酸探针特征特征 由由25个核苷酸组成个核苷酸组成灯中间环形的灯中间环形的15个核苷酸与靶个核苷酸与靶DNA是互补序列；灯是互补序列

16、；灯竿一端的竿一端的5个核苷酸与另一端的个核苷酸与另一端的5个核苷酸是互补个核苷酸是互补在在5 和和3端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧光素（熄灭剂）光素（熄灭剂） 分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶个核苷酸与靶DNA或或RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相

17、互分离，产序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相互分离，产生荧光生荧光三、核素标记三、核素标记 标记核酸的核素有标记核酸的核素有32P、33P、35S和和3H。其中。其中 32P是制备是制备高比活度放射性探针常用的一种同位素；高比活度放射性探针常用的一种同位素；33P比比32P使用安使用安全；全；35S能量低，不会引起核酸损伤，常用于制备稳定的比能量低，不会引起核酸损伤，常用于制备稳定的比活度低的探针，但对许多酶的活性有影响；活度低的探针，但对许多酶的活性有影响；3H标记的探针标记的探针常用于原位杂交、核酸的合成和降解分析常用于原位杂交、核酸的合成和降解分析 由于不同放射性同位素对人体伤害和环境污染

18、程度不同，由于不同放射性同位素对人体伤害和环境污染程度不同，因此实际操作时根据检测要求结合实验室条件选择相应的因此实际操作时根据检测要求结合实验室条件选择相应的标记方法标记方法（一）双链（一）双链DNA探针探针1.切口平移法切口平移法原理原理 类似于非核素类似于非核素DIG标记中的切口平移法，所不同的标记中的切口平移法，所不同的是，此处用高放射活性标记的核苷酸置换原来的核苷酸是，此处用高放射活性标记的核苷酸置换原来的核苷酸操作要点操作要点 将将DNase和和E.coli-DNA-pol催化的反应分催化的反应分开进行，这样可避免开进行，这样可避免DNase在聚合反应过程中降解在聚合反应过程中降解

19、DNA2.随机引物介导法随机引物介导法 方法与方法与DIG-随机引物介导法制备随机引物介导法制备DNA探针相似，即用探针相似，即用DNase水解小牛胸腺水解小牛胸腺DNA（或鲑鱼精（或鲑鱼精DNA），产生），产生612核苷酸的单链核苷酸的单链DNA或随机或随机6聚合体核苷酸的混合物作为引聚合体核苷酸的混合物作为引物；以变性的闭环物；以变性的闭环DNA或线性或线性DNA作为模板，在作为模板，在klenow片段的催化作用下，介导产生片段的催化作用下，介导产生DNA探针探针 分为分为游离游离DNA片段为模板片段为模板和和固定固定DNA片段为模板片段为模板制备制备探针探针（1）以游离）以游离DNA片段

20、为模板制备探针片段为模板制备探针 模板模板DNA用限制性内切酶消化，电泳纯化或乙醇沉淀用限制性内切酶消化，电泳纯化或乙醇沉淀后，与其他试剂混合制备探针后，与其他试剂混合制备探针（2）以固定）以固定DNA片段为模板制备探针片段为模板制备探针 DNA经电泳后，用经电泳后，用EB染色，切下染色，切下DNA色带，加水后沸色带，加水后沸水浴使其变性，然后水浴使其变性，然后37（固定固定），再加其他试剂室温或），再加其他试剂室温或37制备探针制备探针（二）（二）RNA探针的制备（体外转录法）探针的制备（体外转录法）四、标记物纯化四、标记物纯化 标记物纯化就是除去未标记的同位素或非同位标记物纯化就是除去未标

21、记的同位素或非同位素产物素产物 并非所有探针都需纯化，通常用于膜杂交的探并非所有探针都需纯化，通常用于膜杂交的探针不需纯化，而用于原位杂交的探针则需要纯化。针不需纯化，而用于原位杂交的探针则需要纯化。常用的纯化方法有常用的纯化方法有萃取萃取/沉淀法沉淀法、层析法层析法、离心法离心法和和电泳法电泳法等等（一）（一）EtOH沉淀法沉淀法加加1l糖原溶液（糖原溶液（20mg/ml20mg/ml）到含探针的试管中，混匀）到含探针的试管中，混匀加加2 23 3倍体积冷倍体积冷EtOH，低温，低温沉淀，离心分离沉淀，并用沉淀，离心分离沉淀，并用少量少量70%70%冷冷EtOH洗涤洗涤干燥的沉淀物溶于干燥的

22、沉淀物溶于TE缓冲液中，低温贮存缓冲液中，低温贮存（二）层析法（二）层析法SepharoseCL-4B柱层析柱层析 层析结果用层析结果用PAGE检测检测SephadexG-50或或G-25柱层析柱层析五、探针的鉴定五、探针的鉴定 主要鉴定探针的长度、示踪物的掺入率及特异性主要鉴定探针的长度、示踪物的掺入率及特异性（一）杂交法（一）杂交法用靶用靶DNA或或RNA鉴定探针的特异性鉴定探针的特异性根据示踪物的性质，采取相应方法（如荧光、化学发根据示踪物的性质，采取相应方法（如荧光、化学发光、酶联免疫等）检测其含量光、酶联免疫等）检测其含量根据凝胶电泳根据凝胶电泳Rf值检测探针长度值检测探针长度（二）

23、酸沉淀法（二）酸沉淀法 主要用于测定放射性核素标记的探针，检测放射性核素主要用于测定放射性核素标记的探针，检测放射性核素的掺入率。的掺入率。原理：原理：先用强酸（如冰乙酸）沉淀探针（与前体先用强酸（如冰乙酸）沉淀探针（与前体dNTP、NTP分离），再测定其放射性强度；根据放射性强度计算分离），再测定其放射性强度；根据放射性强度计算放射性核素的掺入率放射性核素的掺入率（三）色谱法（三）色谱法 如用如用DIG标记的探针其酯溶性增强，可用标记的探针其酯溶性增强，可用RP-HPLC分分离检测离检测 ?（四）比色法（四）比色法 根据标记物在某条件下能呈色的性质，采取相应的显根据标记物在某条件下能呈色的性

24、质，采取相应的显色剂显色后，比色色剂显色后，比色（五）发光法（五）发光法 先用紫外照射法将靶先用紫外照射法将靶DNA交联到膜（如尼龙膜）交联到膜（如尼龙膜）上，再使探针上，再使探针DNA或或RNA与交联到膜上的与交联到膜上的DNA杂交，杂交，封藏，至暗室中暴光，用合适的封藏，至暗室中暴光，用合适的X线片接收，并用图线片接收，并用图像仪对印记斑点进行扫描像仪对印记斑点进行扫描 第二节第二节 蛋白质蛋白质( (酶、抗体酶、抗体) )标记标记 通常通常抗体与抗原抗体与抗原、酶与底物酶与底物、激素与受体激素与受体等物等物质之间发生的特异反应，其结果通常不能从检测仪质之间发生的特异反应，其结果通常不能从

25、检测仪上直接读出或者用肉眼查觉，一般都需要借助发色、上直接读出或者用肉眼查觉，一般都需要借助发色、发光试剂，或者同位素、酶试剂标记产生具有发光试剂，或者同位素、酶试剂标记产生具有高度高度专一性的探针专一性的探针来判断来判断目目 的的掌握蛋白质的常见标记物的种类及标记方法掌握蛋白质的常见标记物的种类及标记方法掌握核素和非核素标记掌握核素和非核素标记一、标记方法一、标记方法 抗体（抗体（IgGIgG）或蛋白质的标记方法包括）或蛋白质的标记方法包括 酶标记酶标记、荧光标记荧光标记、生物素标记生物素标记、有色金属标记有色金属标记等等 1 1、酶标记、酶标记 l常用于标记抗体的常用于标记抗体的酶酶 辣根

26、过氧化酶辣根过氧化酶(HRP)碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP) 半乳糖苷酶半乳糖苷酶(galactosidase)l由由抗体抗体-酶酶制成的偶联体制成的偶联体(或称特异性探针或称特异性探针)的用途：的用途： ELISA、免疫印迹、细胞和组织化学免疫染色、免疫印迹、细胞和组织化学免疫染色 (1)(1)辣根过氧化酶辣根过氧化酶(HRP)(HRP)抗体偶联抗体偶联 A 过碘酸盐过碘酸盐(periodate)(periodate)法法 B B 戊二醛戊二醛(glutaric dialdehyde)(glutaric dialdehyde)法法 原理：原理：HRP是一种糖蛋白，糖链部分无活性，其己糖邻位是

27、一种糖蛋白，糖链部分无活性，其己糖邻位-OH可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，并与可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，并与IgGIgG中游离中游离-NH-NH2 2共共价结合成价结合成HRP-IgGHRP-IgG偶联物偶联物 。此酶标抗体可直接使用，或凝此酶标抗体可直接使用，或凝胶过滤纯化后使用胶过滤纯化后使用（是制备酶标抗体的有效方法）（是制备酶标抗体的有效方法）原理：原理：先将戊二醛偶联到先将戊二醛偶联到HRP，用凝胶过滤除去多余的戊，用凝胶过滤除去多余的戊二醛，再与二醛，再与IgGIgG偶联；制成的的偶联；制成的的HRP-IgGHRP-IgG偶联物需纯化分离偶联物需纯化分离后使用后使用 (2)(2)碱

28、性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP)(AKP)抗体偶联抗体偶联 原理：原理：戊二醛一步法，即通过戊二醛将戊二醛一步法，即通过戊二醛将AKPAKP与与IgGIgG偶联成偶联成酶标抗体酶标抗体 此法偶联效果好，酶活性较高；但偶联时需用高浓此法偶联效果好，酶活性较高；但偶联时需用高浓度的酶和抗体；成品需在有抑菌剂（如度的酶和抗体；成品需在有抑菌剂（如NaNNaN3 3等）存在的等）存在的条件下保存条件下保存 (3)(3)半乳糖苷酶抗体偶联半乳糖苷酶抗体偶联 A A 戊二醛一步法戊二醛一步法 将将IgGIgG与与-半乳糖苷酶按一定比例溶解于半乳糖苷酶按一定比例溶解于PBSPBS溶液中，溶液中，透析后加入透析后

29、加入戊二醛偶联戊二醛偶联B MBSB MBS法法 MBSMBS（间位（间位- -马来酰胺苯马来酰胺苯-N-N-羟基琥珀酰亚胺酯）为羟基琥珀酰亚胺酯）为一种双功能试剂，可连接带一种双功能试剂，可连接带-NH-NH2 2或含或含-Cys-Cys的蛋白质。的蛋白质。 由于由于IgGIgG不含不含-Cys-Cys，故先让，故先让MBSMBS与与IgGIgG 的游离的游离-NH-NH2 2偶偶联，经透析除去游离的联，经透析除去游离的MBSMBS后，后，IgG-MBSIgG-MBS再与再与-半乳糖半乳糖苷酶偶联苷酶偶联 (4)HRP(4)HRP与抗与抗- -磷酸酪氨酸抗体偶联磷酸酪氨酸抗体偶联 是将是将H

30、RPHRP偶联到抗偶联到抗-磷酸酪氨酸抗体上，制成的酶标磷酸酪氨酸抗体上，制成的酶标抗体；可直接检测蛋白质酪氨酸磷酸化情况抗体；可直接检测蛋白质酪氨酸磷酸化情况 2 2、荧光染料标记、荧光染料标记 常见的荧光染料常见的荧光染料 荧光素荧光素(nuorescien)(nuorescien)、罗丹明罗丹明(rhodamine)(rhodamine)、德克萨斯德克萨斯红红(texas red)(texas red)、藻红朊、藻红朊(rhycoerythrin(rhycoerythrin，PE)PE)、四甲基罗、四甲基罗丹明丹明(tetramethylrho-damine)(tetramethylrh

31、o-damine)荧光染料标记的优点荧光染料标记的优点 标记抗体或蛋白质后会标记抗体或蛋白质后会增加发色强度、缩小波长范围，为增加发色强度、缩小波长范围，为直接观察创造了条件直接观察创造了条件 (2)(2)二氯三嗪基氨基荧光素（二氯三嗪基氨基荧光素（DTAF)-DTAF)-抗体偶联抗体偶联(3)CyDye(3)CyDye荧光染料荧光染料- -抗体偶联抗体偶联特点：特点：荧光染料可直接与二抗偶联，不需要反应底物荧光染料可直接与二抗偶联，不需要反应底物 CyDyeCyDyeULSULS标记的核苷酸和切口转移试剂盒，使用标记的核苷酸和切口转移试剂盒，使用CyDyeTMCyDyeTM荧光染料可以直接标

32、记荧光染料可以直接标记PCRPCR产物产物采用荧光染料制备荧光素采用荧光染料制备荧光素- -抗体偶联的探针的方法抗体偶联的探针的方法 (1)(1)异硫氰酸盐衍生物异硫氰酸盐衍生物- -抗体偶联抗体偶联 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FTTCFTTC）、罗丹明）、罗丹明异硫氰酸盐和四甲异硫氰酸盐和四甲基罗丹明异硫氰酸（基罗丹明异硫氰酸（TRITCTRITC） 3 3、生物素标记、生物素标记生物素标记的特点生物素标记的特点 蛋白质蛋白质( (如酶和抗体如酶和抗体) )与小分子生物素偶联后，并不会与小分子生物素偶联后，并不会改变其生物活性，反而可提高检测灵敏度改变其生物活性，反而可提高检测灵敏度

33、(1)(1)生物素标记抗体生物素标记抗体 一般先将生物素制备成一般先将生物素制备成生物素琥珀酰亚胺酯生物素琥珀酰亚胺酯（可直（可直接购买），然后与接购买），然后与IgGIgG按一定比例反应标记按一定比例反应标记 (2)(2)生物素标记蛋白质生物素标记蛋白质 常用于标记蛋白质的生物素衍生物及标记原理常用于标记蛋白质的生物素衍生物及标记原理 生物素生物素- -羟基琥珀酰亚胺（羟基琥珀酰亚胺（BNHSBNHS） 在碱性条件下，可将生物素与蛋白质的在碱性条件下，可将生物素与蛋白质的-NH-NH2 2偶联；也可用于标记偶联；也可用于标记抗体、激素，或其他含抗体、激素，或其他含LysLys残基残基的多肽。

34、此法制备的标记物稳定，标记的多肽。此法制备的标记物稳定，标记效率高效率高生物素马来酰亚胺生物素马来酰亚胺 适用于含适用于含LysLys残基或残基或含含-SH-SH的蛋白质的标记的蛋白质的标记 马来酰亚胺通过提供马来酰亚胺通过提供间隔臂间隔臂使生物素与蛋白质结合使生物素与蛋白质结合生物素肼生物素肼 通过碳二亚胺（缩合剂）将生物素标记到蛋白质或肽的通过碳二亚胺（缩合剂）将生物素标记到蛋白质或肽的AspAsp或或GluGlu的的- -COOHCOOH上上生物素标记蛋白质的操作生物素标记蛋白质的操作 试剂：试剂：生物素酰氨基己酸生物素酰氨基己酸N-N-羟基琥珀亚胺酯；羟基琥珀亚胺酯； 间隔臂间隔臂-

35、-氨基己酸氨基己酸操作：操作：所有的试剂要在用时配制，生物素衍生物是溶在重蒸所有的试剂要在用时配制，生物素衍生物是溶在重蒸的的DMFDMF（二甲基甲酰胺）或（二甲基甲酰胺）或DMSODMSO（二甲亚砜）（二甲亚砜）4、金标记、金标记原理原理 借助金粒的电子密度特征，用其与抗体偶联后，可成功借助金粒的电子密度特征，用其与抗体偶联后，可成功地置显微镜下观察地置显微镜下观察胶体金颗粒胶体金颗粒分类及用途分类及用途 一般分为三种：一般分为三种：5 nm、l0 nm和和20 nm5nm粒子粒子容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，适用于电子显容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，适用于电子显微镜准确定位抗原微镜准确

36、定位抗原l0nm粒子粒子较大，可使细胞表面染色，适用于光学显微镜观察较大，可使细胞表面染色，适用于光学显微镜观察20nm粒子粒子可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色简要操作简要操作 (1)(1)制备抗体制备抗体 以相应抗原作为配体，与以相应抗原作为配体，与CNBrCNBr活化的活化的Sepharose-4BSepharose-4B偶联制成的偶联制成的亲和吸附剂亲和吸附剂，装柱后用于分离纯化抗体，装柱后用于分离纯化抗体(2)(2)制备金粒制备金粒 5nm5nm金粒金粒a a用用100100二乙酯二乙酯(diethyl ether)(diethyl

37、ether)制备饱和磷制备饱和磷(phosphorus)(phosphorus)溶液溶液(A)(Merck)(A)(Merck)，然后将棒状磷保存在水中并切成小段，迅速转移到然后将棒状磷保存在水中并切成小段，迅速转移到10ml 10010ml 100二乙酯中，密二乙酯中，密封封2h2h以上以上b b离心收集固体部分，用离心收集固体部分，用1 1份溶液份溶液A A与与4 4份酯混合份酯混合( (溶液溶液B)B)，同时制备，同时制备1 1HAuCl4(HAuCl4(氯金酸盐氯金酸盐) )，用，用0.22m0.22m滤膜过滤滤膜过滤c c在装有冷凝迥流管的长颈烧瓶中，加在装有冷凝迥流管的长颈烧瓶中，

38、加3mlHAuCl43mlHAuCl4溶液、溶液、240ml H2O240ml H2O，混匀后，混匀后，加加5.4ml K2C035.4ml K2C03溶液调溶液调pHpH到到9.09.0d d在搅拌下，加在搅拌下，加2ml2ml溶液溶液B B到到HAuCl4HAuCl4溶液中，于室温缓慢混合溶液中，于室温缓慢混合15min15mine e加热迥流，除去二乙酯，冷却到加热迥流，除去二乙酯，冷却到44，制备的胶体金溶液可使用两星期，制备的胶体金溶液可使用两星期12nm金粒金粒 在快速搅拌下，加在快速搅拌下，加10ml 0.07抗坏血酸溶液到一混合溶抗坏血酸溶液到一混合溶液液(1ml l(1ml

39、lHAuCl4HAuCl4，1.5m1 0.2mol1.5m1 0.2molL KL K2 2COCO3 3和和25ml H25ml H2 2O O中，然后补加蒸中，然后补加蒸馏水到馏水到100ml100ml，除抗坏血酸钠溶液外，其余溶液都要经，除抗坏血酸钠溶液外，其余溶液都要经0.22m0.22m滤膜过滤滤膜过滤1720nm金粒金粒 制备制备4 4HAuClHAuCl4 4储备液储备液(Merck)(Merck)，经，经0 022m22m滤膜过滤滤膜过滤后，取后，取0.5ml 40.5ml 4HAuClHAuCl4 4溶液加到溶液加到200ml200ml水水( (终浓度终浓度0.010.01

40、) )中，煮沸，然中，煮沸，然后加后加6ml 16ml 1柠檬酸钠溶液，加热迥流柠檬酸钠溶液，加热迥流0.5h0.5h，冷却到，冷却到44，该胶体金溶液，该胶体金溶液使用时间同上使用时间同上40nm金粒金粒 制备方法同上，仅仅是将制备方法同上，仅仅是将1柠檬酸钠溶液用量由柠檬酸钠溶液用量由6ml改为改为3ml3ml(3)(3)胶体金与抗体的连接胶体金与抗体的连接抗体抗体 将抗体溶液将抗体溶液(1mg/ml)(1mg/ml)对对2mmol2mmolL L硼酸缓冲液硼酸缓冲液(pH9.0)(pH9.0)透析，离心透析，离心(100 (100 000g000g，1h1h，44，收集上清液立即与胶体金

41、偶联，收集上清液立即与胶体金偶联( (用不同稀释度抗体溶液与胶金用不同稀释度抗体溶液与胶金偶联，以确定最佳浓度偶联，以确定最佳浓度) )胶体金胶体金 胶体金溶液经离心胶体金溶液经离心3000g3000g，15min(15min(收集收集5 512nm12nm粒子粒子) )；500g500g，15min(15min(收集收集202040nm40nm粒子粒子)后，取后，取5ml5ml上清液上清液pH(pH(已用已用0.2mol0.2molLK2CO3LK2CO3调节调节) )与与偶联抗体偶联抗体pIpI相近，用抗血清作偶联物时，其相近，用抗血清作偶联物时，其pH9.0pH9.0与与0.5ml0.5

42、ml抗体溶液迅速混抗体溶液迅速混合合lminlmin，加，加100l10100l10NaClNaCl溶液，溶液，5min5min后，测定后，测定A280A280，以确定最佳抗体量，以确定最佳抗体量 偶联偶联 将将0.5mL0.5mL抗体溶液抗体溶液( (约约0.5mg0.5mgml)ml)与与5ml5ml胶体金溶液胶体金溶液(pH(pH已调已调) )迅速混匀，迅速混匀，2min2min后，加后，加1010BSABSA溶液溶液(pH=9.0)(pH=9.0)，令其终浓度为，令其终浓度为1010，静置，静置151530min30min，离心，离心60 000g60 000g，1h(51h(512n

43、m12nm粒子粒子) )；14000g14000g，1h(20-40nm1h(20-40nm粒子粒子)，获得抗体，获得抗体- -胶体金胶体金偶联物偶联物洗涤洗涤 在偶联物中加含在偶联物中加含1 1BSABSA的的20mmol20mmolL TrisL Tris缓冲液缓冲液(pH8.2(pH8.2，经，经0.22gm0.22gm滤滤膜过滤膜过滤) )，平衡洗涤，平衡洗涤151530min30min，重复离心，最终得到悬于，重复离心，最终得到悬于1 1BSABSA溶液的抗体溶液的抗体- -胶胶体金悬液体金悬液( (加加0.02mol0.02molLNaN3)LNaN3)，测定，测定A520A520

44、。不同悬粒如。不同悬粒如40nm40nm、20nm20nm和和5nm5nm的悬的悬浮液浮液A A值应分别控制在值应分别控制在0.350.35、0.50.5和和0.250.25。该法的标记率为。该法的标记率为70708080二、核素和非核素标记二、核素和非核素标记 许多蛋白质在合成过程或合成之后可通过修饰或标记生成磷酸化蛋许多蛋白质在合成过程或合成之后可通过修饰或标记生成磷酸化蛋白质，这种蛋白对某些功能起到敏感可逆的调节作用。在真核细胞中，白质，这种蛋白对某些功能起到敏感可逆的调节作用。在真核细胞中，细胞的增殖、分化、周期调控、信号传导和代谢过程都受制于细胞的增殖、分化、周期调控、信号传导和代谢

45、过程都受制于蛋白激酶蛋白激酶和磷酸酶和磷酸酶活性的平衡。如用核素和非核素标记探针联合检测环化激酶活性的平衡。如用核素和非核素标记探针联合检测环化激酶(cycle dependent kinases(cycle dependent kinases，CDK)CDK)磷酸化和脱磷酸化的反应，可以深刻磷酸化和脱磷酸化的反应，可以深刻地地认识细胞周期的调控认识细胞周期的调控过程。近十年深入研究也为揭示肿瘤细胞的增殖过程。近十年深入研究也为揭示肿瘤细胞的增殖机理和药物治疗提供了不少理论依据。胞外配体机理和药物治疗提供了不少理论依据。胞外配体( (如多肽生长因子如多肽生长因子) )、胞、胞内信号传递因子内信

46、号传递因子( (如如cAMPcAMP）以及钙离子的浓度与相应蛋白激酶的密切关系）以及钙离子的浓度与相应蛋白激酶的密切关系都是受蛋白质磷酸化作用调节控制的。这部分将重点介绍如何通过检测都是受蛋白质磷酸化作用调节控制的。这部分将重点介绍如何通过检测激酶或磷酸化酶来确定蛋白质磷酸化反应，如何用标记探针来鉴定蛋白激酶或磷酸化酶来确定蛋白质磷酸化反应，如何用标记探针来鉴定蛋白质磷酸化质磷酸化3232P P、3333P P、3 3H H、1414C C和和125125I I等物质都可用于标记蛋白质等物质都可用于标记蛋白质 1、核素标记、核素标记(1)32p(1)32p正磷酸盐正磷酸盐(orthophosp

47、hate)(orthophosphate)原理原理 通过体内生物合成法来标记酶或蛋白质通过体内生物合成法来标记酶或蛋白质操作操作 用用HRPHRP标记抗标记抗- -磷酸酪氨酸抗体的试剂，并直接检测蛋磷酸酪氨酸抗体的试剂，并直接检测蛋白质的酪氨酸磷酸化白质的酪氨酸磷酸化材料材料 表皮生长因子表皮生长因子(EGF)(EGF)刺激刺激A431A431细胞株激活酪氨酸激酶，并细胞株激活酪氨酸激酶，并使其受体上的酪氨酸发生磷酸化作用，用未刺激的使其受体上的酪氨酸发生磷酸化作用，用未刺激的A431A431细胞细胞株作对照株作对照 操作操作A.A.免疫沉淀免疫沉淀 细胞萃取溶液用抗细胞萃取溶液用抗-EGFR

48、-EGFR抗体进行免疫反应抗体进行免疫反应1h1h，然后将然后将EGFREGFR 抗抗-EGFR-EGFR抗体复合物在蛋白质抗体复合物在蛋白质G-G-琼脂糖凝胶进琼脂糖凝胶进行免疫沉淀反应行免疫沉淀反应B.B.分离抗体复合物分离抗体复合物 经经SDS-PAGE(8SDS-PAGE(8) )分离后，转移抗体复分离后，转移抗体复合物到合物到PVDFPVDF膜上膜上C.C.印记检测印记检测 按蛋白质印迹法操作，用按蛋白质印迹法操作，用HRP-HRP-抗抗- -磷酸酪氨酸磷酸酪氨酸抗体进行免疫反应后，再与发光底物抗体进行免疫反应后，再与发光底物ECLECL反应，接着置感光反应，接着置感光片上，曝光片上

49、，曝光5min5min检测，结果表明在检测，结果表明在EGFEGF刺激的细胞中刺激的细胞中EGFEGF受体受体酪氨酸磷酸化的数量明显升高酪氨酸磷酸化的数量明显升高 (2) (2) 3232PP或或3232P-ATPP-ATP 原理原理 它们是通过体外生物合成使蛋白质磷酸化和脱磷酸化的它们是通过体外生物合成使蛋白质磷酸化和脱磷酸化的操作程序操作程序(3)(3)3 3H H、1414C C或或125125I I 原理原理 它们可以标记到底物，通过检测由底物生成产物的量，它们可以标记到底物，通过检测由底物生成产物的量，即可换算出相应激酶的活性即可换算出相应激酶的活性(体外检测体外检测) 示意图示意图

50、 底物底物 + ATP 产物产物 + ADP 激酶激酶 (4)(4)其他核素其他核素 3535S S蛋氨酸、蛋氨酸、3535S S半胱氨酸或者半胱氨酸或者3 3H-H-亮氨酸等亮氨酸等 2 2、非核素标记、非核素标记 许多蛋白质的丝氨酸和苏氨酸可以磷酸化，而不少与信号许多蛋白质的丝氨酸和苏氨酸可以磷酸化，而不少与信号传递有关的蛋白质磷酸化又多发生在酪氨酸上。现在已有抗传递有关的蛋白质磷酸化又多发生在酪氨酸上。现在已有抗- -磷酸丝氨酸、抗磷酸丝氨酸、抗磷酸苏氨酸和抗磷酸苏氨酸和抗- -磷酸酪氨酸的抗体商品，磷酸酪氨酸的抗体商品，其特异性较强，灵敏度较高。用这类抗体进行免疫印迹试验其特异性较强，

51、灵敏度较高。用这类抗体进行免疫印迹试验就能便捷地检测出它们的磷酸化程度。就能便捷地检测出它们的磷酸化程度。在在SDS-PAGESDS-PAGE中，由于中，由于磷酸化与未磷酸化蛋白质的等电点不同，所以致使它们二者磷酸化与未磷酸化蛋白质的等电点不同，所以致使它们二者的迁移率出现差异的迁移率出现差异。将温育的与未温育的磷酸化蛋白质。将温育的与未温育的磷酸化蛋白质( (酶酶) )和磷酸酶反应液进行和磷酸酶反应液进行SDS-PAGESDS-PAGE，从蛋白质，从蛋白质( (酶酶) )迁移率的变化迁移率的变化可以推论蛋白质可以推论蛋白质( (酶酶) )磷酸化的程度。此法在采用效率很差磷酸化的程度。此法在采

52、用效率很差3232P-P-ATPATP或或3333P-ATPP-ATP标记时，尤为适用，其操作详见应用实例标记时，尤为适用，其操作详见应用实例 3 3、关于样品分析的若干问题、关于样品分析的若干问题(1)SDS(1)SDS处理细胞处理细胞(2)(2)蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂(3)(3)酶或蛋白质的免疫沉淀酶或蛋白质的免疫沉淀(4)(4)磷酸酶消化磷酸酶消化(5)(5)标记磷酸氨基酸的鉴定标记磷酸氨基酸的鉴定(6)(6)体外酶活性测定体外酶活性测定 4、应用实例、应用实例 肌肉分化期的肌肉分化期的MEF(myogenin E family)2MEF(myogenin E family)2蛋白质磷酸化与磷蛋白质磷酸化与磷酸肌醇磷脂酸肌醇磷脂3-3-激酶激酶(P13-K)(P13-K)和