tspot.tb 朝阳 呼吸

1、结核感染T细胞斑点检测免疫斑点法什么是结核病 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌能侵入全身各个器官，但80%发生在肺部，常称肺结核。 结核病又称为“痨病和“白色瘟疫，是一种古老的传染病。 人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者，而肺外结核病那么不具有传染性。结核分枝杆菌复合群MTC 结核分枝杆菌MTB 牛分枝杆菌 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌 对人致病 抗痨药物治疗有效结核菌特点 潜伏性 结核感染者体内的结核杆菌可长期潜伏在体内，伺机 “复燃发病。 持留性 治疗后还有一些代谢缓慢或间歇性代谢的病菌，它们可长期潜伏于巨噬细胞或闭合的干酪样病灶内，我们称之

2、为持留菌。这些持留菌是引起结核病复发、恶化的主要根源。 耐药性 治疗结核病需要联合用药，发挥药物间的协同或相加作用，全方位杀灭病菌，以大大提高治愈率，结核病疫情全球全球 20亿人口感染结核 现有活动性结核病患者2000万 新增活动性结核病人约900万/年 每年200-300万患者死亡结核病疫情续我国是22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二位，具体表现为“6多：感染人数多亿人口感染过结核菌患病人数多现有活动性肺结核患者450万新发患者多145万/年死亡人数多13万/年农村患者多80%集中在农村耐药患者多全国耐药率28%肺外结核结核分枝杆菌能侵染全身大局部器官，其中有20%发生在

3、肺外非结核分枝杆菌病NTM非结核分枝杆菌病是指感染了NTM，并引起相应器官或组织病变。迄今为止，共发现NTM菌种154种，NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官并可引起全身播散性疾病。人可从环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径。NTM病发病率明显增长，其发病约占结核病的十分之一。已成为人们关注的重要课题。结核病与结核感染接触活动性结核病患者接触活动性结核病患者暴露程度缺乏，结核杆菌被机体免疫力去除暴露程度缺乏，结核杆菌被机体免疫力去除-没有病症没有病症, ,结核杆菌仍旧结核杆菌仍旧存在而不能被侦测存在而不能被侦测 - X- X-光光/ CT / CT 扫

4、描显示正常扫描显示正常-没有抗体应答没有抗体应答-诊断困难诊断困难-传统的结核感染检测只有传统的结核感染检测只有 TSTTSTPPDPPD机体被感染机体被感染受机体免疫力抑制受机体免疫力抑制没有临床病症没有临床病症终身处于感染状态终身处于感染状态潜伏感染潜伏感染有临床病症有临床病症具有传染性具有传染性-结核杆菌可以通过涂片、结核杆菌可以通过涂片、培养检测出培养检测出-胸部的胸部的 X- X-光或光或 CT CT 扫扫描显示异常描显示异常 -肺外结核难以诊断肺外结核难以诊断 ( (特别是儿童特别是儿童)活动性结核活动性结核5%5%再次激活再次激活Respirology (2021) 15, 60

5、3622在接受激素或免疫抑制剂的自身免疫疾病患者中活动性结核病的发病率 远高于健康人群 一项西班牙的研究：在接受激素或免疫拮抗剂治疗的SLE患者中，结核的发病率是健康人群的6倍 香港的研究：同样是接受激素或是免疫拮抗剂治疗的SLE患者，其结核的发病率是普通人群的5-15倍结核病防治难点 传染性：呼吸道 潜伏性：机体免疫系统，约90% 难去除：免疫逃避，休眠状态 再活动：2年内5%，一生5% 肺外结核：比例上升20%，诊断困难 致病复杂性 治疗药物少：有效药物少，没有新药上市，耐药广泛发生早发现早治疗小结1 我国结核病疫情严重，感染率高 肺外结核比例升高，诊断困难 潜伏感染和活动性结核并存，感染

6、基数大，特点条件下容易开展为活动性结核病，所以潜伏感染的诊断也至关重要 非结核分支杆菌的感染增加了诊断困难 结核疫情的控制急需一种高性能的诊断方法二、T-SPOT.TB 简介 操作过程 根本要素 方法比较 性能指标 其它结核感染T细胞检测试剂T-SPOT.TB (英国 牛津)准确 快速一句话概括 结核感染T细胞斑点检测是采用-干扰素释放IGRA原理，结合酶联免疫斑点技术ELISPOT，对机体进行结核杆菌感染检测的方法。 寻找患者体内是否存在结核致敏的T淋巴细胞。操作过程实际效果图阴性结果阴性结果阳性结果阳性结果空白对照空白对照抗原抗原 AESAT-6抗原抗原 BCFP10阳性对照阳性对照PHA

7、结果解释 阴性结果意义 排除结核感染排除结核病帮助临床鉴别诊断 阳性结果意义 结核感染结合临床综合判断疑心根本要素 原理：干扰素释放试验 方法：酶联免疫斑点法 抗原： ESAT-6与CFP 10-干扰素释放实验IGRA干扰素干扰素检测阴性检测阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素酶联免疫斑点技术ELISPOT结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原 Tuberculosis ComplexAntigens Environmental StrainsAntigensESAT-6CFP 10ESAT-6CFP 10M. tuberculosis+M. abcessus-M.

8、africanum+M. avium-M. bovis+M. branderi-BCG substrainM. celatum- gothenburg-M. chelonae- moreau-M. fortuitum- tice-M. gordonae+ tokyo-M. intracellulare- danish-M. kansasii+ glaxo-M. malmoense- montreal-M. marinum+ pasteur-M. oenavense-M. scrofulaceum-M. smegmatis-M. szulgai+M. terrae-M. vaccae-M. xe

9、nopii-结核病的常规诊断方法结核病的常规诊断方法1 1细菌学检查：涂片染色、培养、药敏鉴定细菌学检查：涂片染色、培养、药敏鉴定 是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又消耗时日是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又消耗时日2 2分子生物学检查：分子生物学检查： PCR PCR、基因芯片等、基因芯片等 虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高3 3结核抗体诊断结核抗体诊断 诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方 法之一法之一4 4PPDPPDTSTTST实验实验 传统的结核

10、感染检测方法，对于接种过卡介苗传统的结核感染检测方法，对于接种过卡介苗(BCG)(BCG)或环境分枝或环境分枝 杆菌感染的受试者会出现一定的假阳性结果，对于使用激素或免杆菌感染的受试者会出现一定的假阳性结果，对于使用激素或免 疫抑制剂的受试者会出现一定的假阴性结果疫抑制剂的受试者会出现一定的假阴性结果5 5内窥镜诊断：纤维支气管镜、胸腔镜内窥镜诊断：纤维支气管镜、胸腔镜 侵入性大，患者接受性差侵入性大，患者接受性差6 6影像学诊断：胸片、影像学诊断：胸片、CTCT、MRIMRI、PETPET 具有一定的主观性具有一定的主观性7 7病理学诊断病理学诊断 具有侵入性，标本获取不易具有侵入性，标本获

11、取不易8 8临床疗效临床疗效20212021年年7 7月月2020日，世界卫生组织日，世界卫生组织WHOWHO发出正式声明，要求禁发出正式声明，要求禁止将血清学检测方法抗原，抗止将血清学检测方法抗原，抗体，蛋白芯片等用于肺结核和体，蛋白芯片等用于肺结核和肺外结核的诊断。肺外结核的诊断。WHO warns against the use of WHO warns against the use of inaccurate commercial inaccurate commercial serological tests for serological tests for pulmonary a

12、nd extra-pulmonary and extra-pulmonary TB.pulmonary TB.30临床性能指标 美国美国FDAFDA认证临床实验数据认证临床实验数据 经培养确诊的结核病患者样本经培养确诊的结核病患者样本183183例例 灵敏度灵敏度95.6%(175/183)95.6%(175/183) 306306例入伍新兵例入伍新兵 特异性特异性97.1%(297/306)97.1%(297/306)国外文献汇总灵敏度ReferenceSensitivityKobashi et al. J Infect. 2009; 58(3):197-204 90.0% (36/40)

13、Domnguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2009; 63(1):43-51 84.2% (32/38) Bosshard et al. Respir Med. 2009; 103(1):30-4. 98.4% (62/63) Higuchi Med Microbiol Immunol. 2009; 198(1):33-795.9% (47/49) Kim et al. Am J Med 2009 ;122(2):189-9594.6% (53/56) Nicol et al. Pediatrics. 2009; 123:38-43 50.0% (

14、5/10) Markova et al. Biotechnol. & Biotechnol. 2009;23(1): 1103-110861.5% (8/13) Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*80.8% (80/99) Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7% (36/42) Chee et al J Clin Microbiol. 2008; 46(6):1935-4094.1% (254/270) Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e

15、2624*100.0% (9/9) Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34*87.5% (42/48) Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.*89.9% (62/69) Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*92.2% (59/64) Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3% (57/58) Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90

16、.0% (27/30) Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9% (26/28) Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9% (26/28) Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8*84.6% (11/13) Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-887.2% (34/39) Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9100.0%

17、 (10/10) Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259100.0% (22/22) Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0% (12/12) Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3% (20/24) Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6% (84/87) Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3% (21/23) Meier et al

18、 EJCMID 2005 24;529-53695.9% (70/73) TOTAL91.5% (1205/1317) 国外文献汇总特异性临床性能指标国内临床数据 国内临床数据1163例样本 试验组样本结核病组655例： 按病变部位分类：肺结核582例 肺外结核73例 按抗酸杆菌染色结果分类：“涂阳样本275例 “涂阴样本380例 对照组样本616例：非结核其它疾病样本331例 健康体检者样本177例 国内临床数据灵敏度灵敏度= =95.3%95.3%；特异性；特异性= =94.1%94.1%；阳性预测值阳性预测值=95.4%=95.4%；阴性预测值；阴性预测值=93.9%=93.9%国内临床

19、数据T-SPOT.TB检测结果检测结果分类分类例数例数阳性阳性阳性率阳性率涂片阳性涂片阳性27527526626696.7%96.7%涂片阴性涂片阴性38038035835894.2%94.2%按抗酸杆菌涂片染色结果分类结果说明：结果说明：T-SPOT.TB T-SPOT.TB 不受病毒载量的影响，在不受病毒载量的影响，在“涂阴涂阴的结核病患者中，仍有很高的检出率。的结核病患者中，仍有很高的检出率。国内临床数据T-SPOT.T-SPOT.TBTB检测结果检测结果分类分类例数例数阳性阳性阳性率阳性率肺结核肺结核58258255855895.9%95.9%肺外结核肺外结核7373666690.3%

20、90.3%合计合计65565562462495.3%95.3% 按病变部位分类按病变部位分类结果说明：结果说明：T-SPOT.TB 对肺外结核病患者有很高的检出对肺外结核病患者有很高的检出率，可作为肺外结核快速诊断的有效辅助方法之一率，可作为肺外结核快速诊断的有效辅助方法之一文献数据与成人活动性结核病 最早的研究由英国牛津大学Lalvani A.完成 病例对照研究的方式测试在确诊的活动性结核患者中ELISPOT的阳性率 在HIV 阴性、细菌学阳性的结核病人中阳性率为96%即敏感性为96%，对照组病人其它感染，肿瘤，结缔组织病等，阳性率为8%即特异性为92%) Am J Respir Crit

21、Care Med.2001;163(4):824-8.与成人活动性结核病 2007年Pai M等对近3年的13项研究进行meta分析，这些研究共纳入726例受试者，绝大多数是结核培养阳性、HIV阴性的成年人，分析说明的综合敏感性为90% Ann Intern Med, 2021,149(3):177-184.特异性评价 特异性评价的研究都在结核低流行区进行。Pai M等系统分析中纳入了6项研究，其中5项中的受试者都常规地接受BCG免疫。6项研究共包括290名受试者，93%为无结核接触史的健康成年人，其综合特异性为93% Ann Intern Med, 2021,149(3):177-184.与

22、HIV+活动性结核病 Chapman等的研究中39名HIV阳性的结核患者中的敏感性为90% PPD皮试的阳性率仅为72%AIDS. 2002;16(17):2285-93.与肺外结核病 Ferrara等和Lee等报道的两个前瞻性研究中，共包括18例肺外结核患者，的阳性率为100%Lancet. 2006;367(9519):1328-34.Eur Respir J. 2006;28(1):24-30.与肺外结核病 Kim等随诊72例疑心肺外结核患者的前瞻性研究显示，对于活动性肺外结核和PPD的敏感性分别为94%和47%，差异显著(P0.001) 47%的随诊对象合并有导致免疫低下的情况，包括H

23、IV感染、肿瘤、移植、糖尿病以及自身免疫病等，可能是导致PPD皮试的阳性率显著降低的原因 Arch Intern Med. 2007;167(20):2255-9.与肺外结核病 Liao CHJ Infect. 2021 Oct 9. 等的研究显示，在台湾89例肺外结核患者中具有较高的敏感性和特异性，尤其对于结核性脑膜炎，结核性心包炎，肠结核和淋巴结核，诊断的敏感性到达95%以上与肺外结核病 Cho OHJ Infect. 2021;63(5):362-9 等在368例疑诊肺外结核的患者中研究显示，病变部位不同敏感性不同，诊断淋巴结核和骨结核的敏感性为93，而诊断结核性脑膜炎和粟粒性肺结核的敏

24、感性仅为79。肺外结核的鉴别诊断灵敏度Kim et al., Am. J Med (2021)Immuno-competentImmuno-suppressedIndeterminateTST71.4%(23/35)38.1%(8/21)-The T-SPOT.TB test94.3%(33/35)95.2%(20/21)1.6%(3/186)韩国首尔186名成年人，疑心肺外结核，同时检测T-SPOT.TB和 TST数据说明：T-SPOT.TB是一种有用的结核诊断方法，可以应用于肺外结核病的鉴别诊断，而且不受免疫力状况影响与结核性胸膜炎 Wilkinson等对8名确诊结核性胸膜炎1例合并结核性

25、腹膜炎患者的胸水单核细胞1例腹水以及外周血单核细胞进行了检测，结果显示胸腹水和外周血细胞均为阳性(100%) 同时胸腹水中的阳性细胞计数远高于外周血，平均为外周血阳性细胞计数的15倍 Clin Infect Dis. 2005;40(1):184-7.与结核性胸膜炎 Losi等研究结果:其中95%19/20的结核性胸膜炎患者胸水单核细胞的阳性 同时胸水中阳性细胞计数远高于外周血的阳性细胞计数倍 Eur Respir J. 2007;30(6):1173-9.T-SPOT.TB 特点 特异性好，不受卡介苗BCG接种和环境分枝杆菌影响 灵敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的检出率 标本的获取

26、，肺外结核 快速，24小时报告结果本卷须知抗凝管肝素/肝素锂/肝素钠输血和做PET-CT的受试者建议2周后进行检测样本常温15-25保存，不得冷冻或冷藏样本采集后8小时内完成检测运输过程中防止颠簸，防止样本溶血影响结果免疫力低下的受试者适当提高采血量三、的临床应用应用方向1结核病辅助诊断/疗效评价“菌阴结核病患者的辅助诊断肺外结核的鉴别诊断抗痨治疗的疗效评价2免疫力低下/受抑制患者的结核诊断/感染筛查使用生物制剂/免疫抑制剂患者的结核感染筛查HIV感染者/肾透析患者/器官移植患者3儿童结核病的辅助诊断4结核密切接触者/高危人群的结核感染筛查结核病患者的家属/医务工作者/监狱囚犯5接触追踪呼吸科

27、呼吸科/结核科结核科鉴别诊断：鉴别诊断：COPD，肺癌，肺炎，肺脓肿，支气管炎/支气管扩张，发热性疾病等在肺结核中的应用T-SPOT.TB在在肺结核治疗中结果分析肺结核治疗中结果分析Ribeiro S, Dooley K, et al. BMC Infect Dis, 2021 Ribeiro S, Dooley K, et al. BMC Infect Dis, 2021 方法：在肺结核治疗中，用方法评估治疗效果。在治疗开始前，治疗16周和24周后，分别计数ESAT-6和CFP-10刺激产生的斑点数。图1. 所有研究对象ESAT-6, CFP-10和总RD1在治疗前，16周后和24周后的平均

28、斑点数（n=58）在24周完整疗程后，ESAT-6, CFP-10和总RD1产生的平均SFCs分别从和降到和46.5 。T-SPOT.TB试验中检测的由试验中检测的由RD1特特异异T细胞产生的细胞产生的-干扰素，可能与干扰素，可能与肺结核患者在治疗中的结核杆菌量肺结核患者在治疗中的结核杆菌量直接相关。直接相关。在结核性胸膜炎诊断中的应用在结核性胸膜炎诊断中的应用利用T-Spot TB试验检测PEMCs以此诊断活动性胸膜结核的敏感性和特异性分别为95%和76%。试验组对照组T-SPOT阳性阴性阳性阴性PBMCs90%（18/20）67%（14/21）PEMCs95%（19/20）77%（16/2

29、1）活动性结核与潜伏感染的区分 Janssens等研究了在鉴别潜伏结核和活动性结核中的作用 潜伏结核定义为阳性的无病症接触者 活动性结核患者在治疗2周内进行测试，减小了治疗对检测的影响 值在活动性结核患者中明显高于潜伏结核人群，但两者间的交叉较大，为分界值 Eur Respir J. 2007;30(4):722-8.活动性结核与潜伏感染的区分 Chee等Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2021,28(6):667-670 对230例培养阳性活动性结核患者和183例结核接触者进行了检测，在ESAT-6肽段库中，活动性结核患者与结核接触者的斑点形成细胞数分别为10

30、8 vs. 40 SFC/106PBMC，在CFP-10肽段库中，分别为148 vs. 52 SFC/106PBMC发热待查结核病在发热待查中的比例病例 患者，男，35岁 患者于一月前开始无诱因下出现高热、胸闷，动那么气急，无咳嗽，咯血，盗汗 。 胸片：两肺，心包积液 心超：心包积液 心包穿刺：血性 诊断：肿瘤？结核？细菌感染？检测结果 外周血：阳性 心包积液：阳性 诊断：结核性心包炎 治疗： INH、RFP、PZA、EMB、强的松 体会：诊断快速 心包积液结核培养：6周后报阳 293例疑心结核病的非洲儿童 平均年龄3岁，约46% HIV抗体阳性，多数合并营养不良 57例确诊结核病的儿童中，E

31、LISPOT阳性率81%；TST阳性率35% 年龄、 HIV感染状态和营养不良的严重程度对ELISPOT结果无影响，但均能导致TST结果的显著差异Liebeschuetz et al Lancet. 2004合并结核的相关疾病合并结核的相关疾病艾滋：据报道，艾滋病患者合并结核病感染者为艾滋：据报道，艾滋病患者合并结核病感染者为15.9%50%。HIV的流行已成为全球的流行已成为全球结核病发病率及死亡率第三次上升的主要原因，而结核病也是艾滋病患者最常见的时机结核病发病率及死亡率第三次上升的主要原因，而结核病也是艾滋病患者最常见的时机感染和致死病因。感染和致死病因。风湿病：日前判断风湿病患者是否存在风湿病：日前判断风湿病患者是否存在LTBI，除通过详细询问病史、行，除通过详细询问病史、行x线胸片检查线胸片检查外主要依靠外主要依靠PPD试验的结果。而大局部患者在接受