昆虫对农药抗性的研究进展

1、昆虫对农药抗性的研究进展摘 要：随着化学农药在农林业生产过程中的广泛应用，害虫对农药的抗性不断增强。因此，昆虫对农药的抗性机制已成为当前重要的研究课题之一。现代分子生物学技术的运用使有关抗性机制的研究呈现多层次、多方位的研究特点。综述了近年来有关昆虫抗药性几种机制的研究进展，如代谢抗性机制、靶标抗性机制等，以期为昆虫的抗性研究提供参考。关键词：昆虫；农药；抗性机制长期使用杀虫剂易使昆虫产生不同程度的抗药性，甚至产生交互抗性，从而不利于生态环境的保护和农业生产成本的降低。因此，昆虫的抗性机制研究逐渐成为重要的研究课题之一，在过去的半个多世纪中，人们不断从各个方面对昆虫的抗性机制进行研究，以了解其

2、产生抗性的机理，从而为抗性监测和新农药研制提供依据。昆虫抗性研究从最初的行为、生理到代谢再到作用靶标，实现了跨越式发展。近年来，昆虫抗性机制的研究主要集中于抗性基因的表达和调控。大多数研究认为，昆虫的抗药性机制主要包括药剂穿透率下降、昆虫体内解毒酶活力增强即代谢抗性与靶标敏感性降低等。其中解毒酶主要包括细胞色素P450介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶（GST）、水解酯酶等；3个主要作用靶标分别为乙酰胆碱酯酶（AChE）、神经轴突钠离子通道（SC）和-氨基丁酸（GABA）受体-氯离子通道复合体。而随着昆虫基因组全序列的测序完成以及基因组研究技术的开发运用，大大地促进了抗性基因的鉴别，使昆虫的抗

3、性机制研究在代谢机制和作用靶标这两方面取得了重大突破。1 代谢抗性机制的研究1.1 谷胱甘肽-S-转移酶基因的研究目前，从分子水平上探索谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的作用机制已经十分普遍，PCR等分子生物学技术的应用使人们对昆虫抗性机理的研究迈上了一个新的台阶。潘敏慧等1通过在 sf9 细胞中真核表达家蚕（Bombyx mori）GSTe3，确定了家蚕GSTe3 的表达具有较高的组织特异性，它只在家蚕血液和头部表达，其真核表达产物具有较好的GSTs 酶活性；刘海涛等2研究表明，BmGSTe5 可能是参与合成 GSTs 的主要基因。以GST基因为目标的研究还有很多，这些研究都在一定程度上加深了

4、人们对GSTs抗性机理的了解。1.2 羧酸酯酶基因的研究刘海涛等2推测家蚕对药剂产生抗性可能是因为其体内的羧酸酯酶（CarE）发生了突变，提高了对杀虫剂的水解能力。黄水金等3利用RT-PCR技术和RACE方法获得了1个斜纹夜蛾（Spodoptera litura）CarE基因的全长cDNA序列，命名为Slest2，并推测Slest2的过量表达可能是斜纹夜蛾对溴氰菊酯产生抗性的分子机制之一，这种推测为进一步研究夜蛾科昆虫的抗性机理奠定了基础。兰亦全等4研究也表明羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）对氰戊菊酯和顺式氯氰菊酯产生抗性的重要原因。2 靶标抗性机制的相关研究

5、2.1 乙酸胆碱酯酶基因的研究乙酸胆碱酯酶（AChE）作为抗性机制中的一个重要靶标，成为从基因表达和基因调控角度研究抗性机制的重点。陈亮等5对斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段进行克隆和序列分析，为获取斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶基因全序列以及研究其变构乙酰胆碱酯酶的分子机制奠定了基础。大量试验表明，不敏感AChE对于杀虫剂的抗性归因于很多潜在的与抗性相关的点突变。以AchE基因（ace）为例，昆虫的ace发生突变，其产物AChE发生变构，使其对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性降低，从而使昆虫产生抗药性6。李兵7研究表明，家蚕Bm-ace2和野桑蚕（Bombyx mandarina）Bmm-ace

6、2 的突变是导致其对有机磷农药抗性差异的原因之一。此外，刘海涛等2也发现家蚕雌雄个体之间Bm-ace2基因的表达量不同，导致AChE 的活性存在明显差异，并最终使雌雄个体表现出不同的抗性。研究家蚕AChE活性及其ace基因的表达模式，为探索家蚕对有机磷农药抗性的分子机制提供了依据，并且通过与野桑蚕比较，为家蚕对有机磷农药的抗性退化研究提供新的依据。2.2 钠离子通道蛋白基因的研究赵华强等8以野桑蚕为材料，利用RT-PCR技术克隆了野桑蚕钠离子通道蛋白基因的cDNA片段，发现该基因cDNA片段编码氨基酸序列包括钠离子通道蛋白亚基的跨膜结构域、和，并存在a、b、c 3个选择性微外元。但尚不清楚在发

7、育调控中，这3个微外元对钠离子通道蛋白产生的影响。2.3 烟碱型乙酰胆碱受体的研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）作为昆虫神经系统中最重要的神经递质受体，也是几类重要杀虫剂的作用靶标，近年来在其抗性机理上取得了明显进展。赵宇等9利用RT-PCR和RACE技术，克隆了小菜蛾（Pplutella xylostella）nAChR 亚基的一个新基因Px8，为研究小菜蛾nAChR的亚基类型、亚基组合形式、药理学特征及其在小菜蛾对多杀菌素的靶标抗性机制方面的作用提供了重要依据。此外，在褐飞虱（Nilaparvata lugens）抗性机理的研究中，nAChRs的附属蛋白作用的发现10，也为抗性研究提供

8、了更多的选择。3 其他基因的研究3.1 家蚕SerB基因除了对ace基因的广泛研究，与抗性有关的其他基因也在不断被寻找中。葛君等11发现，家蚕在对有机磷农药代谢解毒过程中磷酸丝氨酸转氨酶（SerB）的表达量增加，其基因mRNA转录与其蛋白的表达呈现相同趋势，推测该基因可能与家蚕对有机磷农药的抗性存在一定关系。3.2 P450基因与AChE相似，P450基因表达量的升高一定程度上增强了昆虫的抗药性。黄水金等12推断细胞色素P450 基因CYP4M14和CYP4S9的过量表达可能与斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性有关。张林林等13在对田间灰飞虱（Laodelphgax striatellus）抗药性

9、进行研究时发现，细胞色素P450的CYP6家族中的10条基因序列以及CYP4家族中的6条基因序列在抗性品系中的表达量明显高于敏感品系。值得注意的是，虽然针对任何一种杀虫剂的高水平抗性，可能只涉及其中少数几个对该化合物有针对性的基因，但仍需关注这些基因的表达对其他基因的影响。4 病原微生物在抗性机理上的研究目前，除了从基因组学角度研究各类酶外，一系列病原微生物与昆虫体内酶的关系的研究也在进行。王龙江等14推测球孢白僵菌（Beauveria bassiana）感染红火蚁（Solenopsis invicta）后，影响了其体内各种酶的活性，导致其体内某一种或几种保护酶的合成受到抑制，从而破坏了这几种

10、酶在昆虫体内的作用或它们之间的协同作用，最终引起寄主一系列的生理病变。其中CarE的活力呈先下降后上升的趋势，而AchE的活力则呈先上升后下降的趋势，说明球孢白僵菌能抑制其体内AchE的活性，这对于以后红火蚁的生物防治具有重要意义，但具体机制还有待进一步研究。另外，研究结果还表明球孢白僵菌侵染红火蚁工蚁后会刺激CarE和AchE活性，产生一种免疫防御反应，这与昆虫对化学农药的抗性机理显著不同14。5 病原微生物与基因组学大肠杆菌（Escherichia coli）是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌15，是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。任文彬等16通过克隆高毒力金龟子绿僵菌（Metarrhizi

11、um anisopliae）中一个几丁质酶基因，构建pGEX-chi融合表达载体，并转化到大肠杆菌BL21中，经SDS-PAGE结果分析显示，表达出的融合蛋白大小为68 kD，占蛋白表达总量的64.5%。该试验从分子生物学和微生物学角度出发，为今后昆虫的抗性机理研究提供了一个很好的例子，为新农药的研究提供了一条新的思路。该试验还成功地在大肠杆菌中高效融合表达了金龟子绿僵菌几丁质酶，为以后对绿僵菌几丁质酶性质与作用的研究奠定了基础。几丁质酶作为入侵宿主的一个重要毒力因子，是生物防治的一个重要选择。郝蕾蕾等17研究结果表明，几丁质酶在球孢白僵菌中分泌达到一定阈值后会显著提高病菌的毒力，但具体机制还

12、有待研究。可能是其直接加剧了对昆虫表皮几丁质的分解，或是通过协助蛋白酶的分泌来强化这种分解。若能确定其作用机理，那么将为昆虫抗性机理研究提供另一个重要依据。6 结语与展望人类与昆虫之间的拉锯战已经持续了数千年，一直到科学技术高度发展的今天仍然进行着。随着人类对昆虫认识水平的深入，防治技术也在不断提高。自20世纪40年代DDT问世以来，人类在这场拉锯战中取得了重大进展，但随之又带来了一系列问题，其中较为紧迫的一项便是昆虫对农药的抗性。寻找新的抗性研究途径一直是人们关注的重点，但在寻找新途径的同时也要对已有途径进行创新利用。对于当前热门的基因工程来说，与微生物研究结合有可能是一条可行性非常高的途径

13、，将引领我们不断探索未知的领域。有害生物综合防治（IPM）技术研究过程中，应该以生态学、多战术、协调共存和经济学这四大观点为主导，立足于生产实践，多角度、多手段地对昆虫抗药性机理进行探索。参考文献1 潘敏慧，许湲，余泉友，等家蚕谷光甘肽-S-转移酶GSTe3基因的鉴定及其真核表达J.中国农业科学，2010，43（4）：873-880.2 刘海涛，李兵，赵国栋，等家蚕幼虫不同龄期体内主要解毒酶及其基因表达的性别差异J.昆虫学报，2010，53（5）： 479-486.3 黄水金，秦文婧，陈琼斜纹夜蛾羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及表达水平J.昆虫学报，2010，53（1）：29-37.4 兰亦全，

14、赵士熙甜菜夜蛾对氰戊菊酯和顺式氯氰菊酯的抗性机理J.应用生态学报，2010，21（1）：203-208.5 陈亮，李兵，浦冠勤斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段的克隆和序列分析J.蚕业科学，2010，36（1）：138-142.6 唐振华，毕强杀虫剂作用的分子行为M.上海：上海远东出版社，2003：641-644.7 李兵家蚕和野桑蚕对有机磷农药抗性的研究D.苏州：苏州大学，2009：14-20.8 赵华强，宋丽莉，李兵，等野桑蚕钠离子通道蛋白基因 Bmmpara 的克隆与选择性剪接J.蚕业科学，2010，36（3）：435-441.9 赵宇，杨亦桦，武淑文，等小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体亚基c

15、DNA的克隆、序列分析与不同发育阶段表达分析J.昆虫学报，2009，52（1）：17-26.10 Yang B, Yao X, Gu S, et al. Selectivity of lynx proteins on insect nicotinic acetylcholine receptors in the brown planthopper, Nilaparvata lugensJ. Insect Mol Biol, 2010, 19(3): 283-289.11 葛君，王举梅，李兵，等杀虫剂辛硫磷诱导家蚕脂肪体蛋白的表达特征及SerB基因的组织转录活性分析J.蚕业科学，2010，36（

16、3）：428-434.12 黄水金，秦文婧，陈琼斜纹夜蛾P450基因 CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究J.中国农业科学，2010，43（16）：3 115-3 124.13 张林林，徐鹿，韩召军田间灰飞虱抗药性相关细胞色素P450基因和酯酶基因的筛选J.南京农业大学学报，2010，33（5）：29-34.14 王龙江，吕利华，谢梅琼，等红火蚁感染白僵菌后体内保护酶和酯酶活性的变化J.华中农业大学学报，2010，29（3）：282-286.15 Nuc P, Nuc K. Recombinant protein production in Escherichia coli

17、 J. Postepy Biochem, 2006, 52(4): 448-456.16 任文彬，张世清，黄俊生金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae HN1）几丁质酶与谷胱甘肽S-转移酶GST在大肠杆菌中的高效融合表达J.安徽农业科学，2009，37（17）：7 900-7 902.17 郝蕾蕾，陈珊珊，谢翎，等几丁质酶基因在球孢白僵菌中的超表达提高其对马尾松毛虫的毒力J.中国生物防治，2010，26（3）：267-273.Research and Progress about Pesticide Resistance of InsectsHUANG Yanjun, PU

18、 Guanqin( Department of Horticulture, Soochow University, Suzhou Jiangsu 215123 )Abstract: As the widely use of chemical pesticides in agriculture and forestry production, the pesticide resistance of insects was the trend of getting stronger. So, researches about resistance mechanism of pesticide have been one of the important issues now. And the use of molecular biology technology made the researches develop variously. T