L-丝氨酸的酶法合成及分析

1、王圆生物制药13132013040928中文名称：L-丝氨酸 外文名称： L-Serine中文别名：L-2-氨基-3-羟基丙酸 分子结构：分子式:C3H7NO3 分子量:105.09物性性质1. 性状：有左旋体和消旋体两种，左旋体是白色六角棱柱状晶体，味甜；消旋体是白色单斜棱柱状晶体。2. 密度（g/mL,25/4）：1.4153. 相对蒸汽密度（g/mL,空气=1）：未确定4. 熔点（C）： 223228(分解)5.溶解性：左旋体，溶于水，不溶于无水乙醇和乙醚；消旋体。略溶于水，不溶于无色乙醇、乙醚。主要用途1.作生化试剂和食品添加剂。2.营养增补剂，在化妆品中作为皮肤营养添加剂。3. 可供

2、生物化学和营养学研究之用，也可作为合成环丝氨酸的原料。原理本项目主要研究丝氨酸羟甲基转移酶催化甘氨酸生成L-丝氨酸。丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）在生物体内是由GlyA 基因编码的，此酶能在四氢叶酸(THF)、甲醛及磷酸吡哆醛5-PLP 存在下，催化甘氨酸生成L-丝氨酸。其反应过程右图所示。材料、试剂、仪器：1、原料：细菌破碎上清液2、主要试剂甘氨酸、甲醛、四氢叶酸、氯化钠、葡萄糖、无水乙醇、氯化钙、氢氧化钠3、主要仪器电子天平，无菌超净工作台，高速离心机、恒温培养箱方法1、甘氨酸浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终浓度分别为6 mmol/L、

3、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L和14mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。2、甲醛浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甲醛至终浓度分别为0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L和20mmol/L，再加入甘氨酸至终浓10mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨

4、酸浓度测定。3、磷酸吡哆醛浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入磷酸吡哆醛至终浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1mmol/L，再加入甘氨酸至终浓度10 mmol/L，甲醛至终浓度10mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。4、 pH确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终浓度为10 mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至

5、终浓度5 mmol/L，并调节不同的pH为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0，37，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。5、 反应时间确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终浓度为10 mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37，190rpm摇床反应时间分别为0h,8h,16h,24h,36h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。原理薄层层析是一种微量而快速的层离方法。这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把

6、要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。材料 1仪器薄层板：615cm（2）、毛细管（4）、烧杯50mL（1）、药匙（1）、量筒10mL（1）、小尺子（1）、层析缸（1）、电吹风（1）、喷雾器（1）、烘箱（200）2. 试剂（1） 标准氨基酸溶液，制备下列各氨基酸的11.76mol/L(90%)异丙醇溶液各10mL。 0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸

7、17.4mg溶于11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL 0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL。 0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL。 （2）硅胶G（C.P.,层析用）。 （3）粘合剂：0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）:取CMCNa5g溶于1000mL蒸馏水中，然后煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清液备用。（4）层析溶剂：正丁醇（分析纯）冰醋酸（分析纯）水602020（V/V），临用时配制。 （5）显色剂：0.025mol/L(0.5%)茚三酮-丙酮溶液:

8、称取茚三酮（A.R.）0.5g溶于无水丙酮（A.R.）至100mL。 （2）硅胶G（C.P.,层析用）。 （3）粘合剂：0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）:取CMCNa5g溶于1000mL蒸馏水中，然后煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清液备用。（4）层析溶剂：正丁醇（分析纯）冰醋酸（分析纯）水602020（V/V），临用时配制。 （5）显色剂：0.025mol/L(0.5%)茚三酮-丙酮溶液:称取茚三酮（A.R.）0.5g溶于无水丙酮（A.R.）至100mL。步骤 1、制板称取层析用的硅胶G3g加9mL0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）,在烧杯中调成均匀糊状，迅速地倾在1块615cm的玻璃板上

9、（玻璃板要清洁平整，无油污），小心将玻璃板轻轻振荡和倾斜，使硅胶均匀铺在玻璃板上。室温下静置半小时，移至105烘箱中烘烤1h，选择厚薄均匀平整的板使用。 （活化：制得的硅胶板如果长时间暴露在外面，在使用前应放入110烘箱中烘烤30分钟，去除水分。）2、点样：活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边2cm水平线上以间距1cm的宽度确定4个点样点（注意点样点尽量靠近板中心），用毛细管吸取氨基酸样品溶液，垂直轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径大约2-3mm，干后再点一次。 3、展层：将薄板有样品的一端浸入扩展剂，扩展剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿达薄板3/4高度时，停止展层

10、，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干。 4、显色：用喷雾器将茚三酮溶液喷洒在薄板上（注意喷雾器和薄板要保持一定距离，不要使硅胶层吹散，且应喷洒均匀），用热吹风吹干（或置于105烘箱中烘干），即可观察到紫红色的氨基酸斑点。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的Rf值。Rf值为迁移率（rate of flow, Rf），在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的Rf值。 注意事项1.由于硅胶的机械性差，必须加入粘合计如煅石膏、淀粉或羧甲基纤维素钠（CMCNa），其中以羧甲基纤维素钠的效果为最好。市售的硅胶G和氧化铝G均已含有粘合剂（煅石膏），可直接加水调匀后铺层，但效果稍差。加粘合剂的薄层板常称硬板，不加粘合剂的薄层板常称为软板。2在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。3配制展层剂时，要用纯溶剂，应现用现配，以免放置过久其成分发生变化（酯化）。4. 层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过