疟疾分子生物学诊断技术

1、疟疾分子生物学诊断技术疟疾分子生物学诊断技术疟疾的诊断疟疾的诊断 疟疾诊断疟疾诊断RDTs1. 疟疾快速诊断试剂；疟疾快速诊断试剂；2. 会出现假阳性或假阴性。会出现假阳性或假阴性。分子生物学分子生物学方法方法1. PCR方法；方法；2. 灵敏度较高，特异性强；灵敏度较高，特异性强；3. 鉴别虫种。鉴别虫种。显微镜检查显微镜检查1. 金标准；金标准；2. 要求镜检员有丰富的镜检要求镜检员有丰富的镜检经验，低密度时易漏检。经验，低密度时易漏检。流行史、临床表现流行史、临床表现1. 流行季节去过流行区、输流行季节去过流行区、输血史；血史；2. 周期性发冷、发热、出汗周期性发冷、发热、出汗。疟疾的分

2、子生物学诊断技术疟疾的分子生物学诊断技术常用的用于疟疾诊断的分子生物学技术：常用的用于疟疾诊断的分子生物学技术：l普通PCRl巢氏PCRl半巢氏PCRl复式PCRl多重PCRl实时荧光定量PCRPCRPCR的原理的原理原理：在模板、引物、原理：在模板、引物、4 4种种dNTPsdNTPs和耐热和耐热DNADNA聚合酶存在的条件下，特异扩聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的增位于两段已知序列之间的DNADNA区段的酶促合成反应。区段的酶促合成反应。PCR PCR 循环循环- -第一步第一步- -加热变性加热变性靶序列靶序列PCR PCR 循环循环- -第二步第二步- -引物与靶序列

3、退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR PCR 循环循环- -第三步第三步- -引物延伸引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后- -得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列靶序列 靶序列BiotinBiotin3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量1 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4

4、 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconNo. of CyclesNo. Amplicon Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8249、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022-3-22022-3-2Wednesday, March 02, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022-3-22022-3-22022-3-23/2/2022 11:47:26 PM11、人总是珍惜为得

5、到。2022-3-22022-3-22022-3-2Mar-222-Mar-2212、人乱于心，不宽余请。2022-3-22022-3-22022-3-2Wednesday, March 02, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022-3-22022-3-22022-3-22022-3-23/2/202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年3月2日星期三2022-3-22022-3-22022-3-215、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。2022年3月2022-3-22022-3-22022-3-23/2/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022-3-22

6、022-3-2March 2, 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022-3-22022-3-22022-3-22022-3-2DNADNA的制备的制备l疟疾疟疾DNADNA样本的准备和保存：样本的准备和保存：抗凝血：全血，短期内存放于4，长期存放于-20。滤纸血：滤纸血样（3-4个血滴）置于封口袋中，短期内存放于4，长期存放于-20。lDNADNA的制备与保存：的制备与保存：参照说明书步骤进行抗凝血或滤纸血DNA的提取，常用QIAamp DNA Blood Mini Kit。DNA长期应于-20冷冻保存。DNADNA的制备的制备DNADNA提取中所需试剂、仪器和设备：提取

7、中所需试剂、仪器和设备：lDNADNA提取试剂盒提取试剂盒l无水乙醇无水乙醇l离心机离心机l恒温水浴锅恒温水浴锅l其他耗材其他耗材PCRPCR反应反应PCRPCR标准反应体系标准反应体系DNA模板引物dNTPTaq DNA 聚合酶Mg2+ddH2OPCR Mix反应缓冲液PCR引物设计原则引物设计原则1、引物长度一般为、引物长度一般为1530个核苷酸个核苷酸2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的的堆积现象。尤其是引物的3端不应有连续端不应有连续3个个G和和C。否。否则会使引物在模板的则会使引物在模板的G+C富集

8、序列区错误配对。富集序列区错误配对。3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。构。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的端的互补重叠。互补重叠。5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。 6、引物、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物配对。引物3端的最佳碱基选择是端的最佳碱基选择是G和和C。7、引物的、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变端可以修饰，如附加限制酶位

9、点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。序列包括起始密码子，终止密码子等。PCRPCR反应反应PCR反应体系：总体积通常为反应体系：总体积通常为20-50 l。（1）模板）模板DNA浓度一般为浓度一般为100ng/100 L，模板浓度过高会导致反应的非，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；特异性增加；（2）引物浓度为）引物浓度为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降；应特异性下降；（3）Taq DNA聚合酶浓度为聚合酶浓度为

10、0.5-2.5U/50 l，酶量增加使反应特异性下，酶量增加使反应特异性下降，而酶量过少影响反应产量。降，而酶量过少影响反应产量。（4）dNTP浓度取决于扩增片段的长度。一般情况下四种浓度取决于扩增片段的长度。一般情况下四种dNTP浓度相浓度相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量；等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量；（5）Mg2+浓度为浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L，它是，它是DNA聚合酶的激活剂，聚合酶的激活剂， Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降产量下降，Mg2+浓度过高影响浓度过高影响反应特

11、异性。反应特异性。PCRPCR反应反应PCR循环参数：（1）变性：9296，30s60s；（2）退火：退火温度由引物长度和GC含量决定，一般在3765，30s60s。（3）延伸：70-75，一般为72，时间为1min2min。（4）循环次数：主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次。次数过多则扩增效率降低，错误掺入率增加。PCRPCR反应反应经典循环参数（500bp以内）。94 5min94 30s 55 45s 30次72 1min72 7min水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平电泳系统凝胶成像系统缓冲液（TBE）琼脂糖核酸染料DNA marker试剂仪器在凝胶中，在凝胶

12、中，DNA片段迁移距离（迁移率）片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。的大小。水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像水平凝胶电泳和凝胶成像巢氏巢氏PCRPC

13、R巢氏PCR原理: 先用外测引物扩增含目的DNA的大片段，再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段。模板DNA加外侧引物A和B引物A 引物BPCR加内侧引物C和D引物CPCR 引物D利用巢式利用巢式PCRPCR检测疟原虫种类检测疟原虫种类：原理原理目标序列：疟原虫SSU RNA基因。利用巢式利用巢式PCRPCR检测疟原虫检测疟原虫：引物：引物反应轮次及不同疟原虫种类引物产物长度（bp）第一轮（属特异性引物）rPLU5：5-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC1 200rPLU6：-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG第二轮（种特异性引物）恶性疟原虫rFAL1：5-TT

14、AAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT205rFAL2：5-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC间日疟原虫rVIV1：5-CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC120rVIV2：5-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA三日疟原虫rMAL1：5-ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC144rMAL2：5-AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA卵形疟原虫rOVA1：5-ATCTCTTTTGCTATTTTTTAGTATTGGAGA800rOVA2：5-GGAAAAGGA

15、CACATTAATTGTATCCTAGTG 巢式PCR检测疟原虫种类的引物及其扩增产物长度利用巢式利用巢式PCRPCR检测疟原虫检测疟原虫：反应体系和条件：反应体系和条件PCR 反应条件：94 3 min，94 30s，58 30s，72 60s，步骤 2至4循环34次后，72 5min。第一轮： 10.1 l ddH2O，1.0 l 10 M引物rPLU5，1.0 l 10 M引物rPLU6，2.0 l 10PCR缓冲液，2.0 l 25 mM MgCl2 ，0.4 l 10 mM dNTPs混合液，0.5 l Taq聚合酶3.0 l DNA第二轮： 11.1 l ddH2O，1.0 l 1

16、0 M引物1，1.0 l 10 M引物2，2.0 l 10PCR缓冲液，2.0 l 25 mM MgCl2 ，0.4 l 10 mM dNTPs混合液，0.5 l Taq聚合酶2.0 l DNAPCR反应体系（20l）利用巢式利用巢式PCRPCR检测疟原虫检测疟原虫：反应体系和条件：反应体系和条件第一轮： 6.8 l ddH2O，0.6 l 10 M引物rPLU5，0.6 l 10 M引物rPLU6，10.0 l PCR mix，2.0 l DNA第二轮： 7.8 l ddH2O，0.6 l 10 M引物rPLU5，0.6 l 10 M引物rPLU6，10.0 l PCR mix，1.0 l

17、DNAPCR 反应条件：94 3 min，94 30s，58 30s，72 60s，步骤 2至4循环34次后，72 5min。PCR反应体系（20l）利用巢式利用巢式PCRPCR检测疟原虫检测疟原虫：凝胶电泳：凝胶电泳检测疟原虫种类的巢式PCR电泳图依据产物的长度，判断疟原虫的种类：恶性疟原虫的扩增条带是 205 bp；间日疟原虫的扩增条带是120 bp；三日疟原虫的扩增条带是144 bp；卵形疟原虫的扩增条带约为800 bp。利用巢式利用巢式PCRPCR检测疟原虫检测疟原虫卵形疟原虫分为P. ovale curtisi 和 P. ovale walliker两种。实时实时定量定量 PCR (

18、real-time PCR)PCR (real-time PCR) 原理：原理：是指在是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。TaqManTaqMan法法TaqMan PCR体系的构成：引物TaqMan探针dNTPs、Taq聚合酶模板缓冲体系TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)

19、 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法real-timereal-time PCRPCR工作原理工作原理典型的典型的Real time PCRReal time PCR四阶段四阶段: : 定量定量PCRPCR与定性与定性PCRPCR的区别的区别定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期；而定性PCR测定的 测定点则多为PCR扩增的平台期。实时在线监控： 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期。降低反应的非特异性：使用引物和荧光探针同时与模板特异

20、性结合，提高了PCR反应的特异性。增加定量的精确性：全程监控，准确的算法进行定量。结果分析更加快捷方便，无需跑胶。PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题现象：阳性对照有条带，而样品则无M样品样品阳对问题1：无扩增产物PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间无扩增产物原因解决方法PCRPCR中易出现的问题中易出

21、现的问题现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题2：非特异性扩增PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数 非特异性扩增原因解决方法PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2问题3：拖尾PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多纯化模板更换Buffer适当提高

22、退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数拖尾原因解决方法PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题问题4：弥散PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题cDNA第一链产物的含量过高DNase降解DNA产生的寡核苷酸的非特异性扩增PCR反应中引物过多循环数过多退火温度过低常规PCR步骤中减少模板cDNA的量提取高质量RNA，防止被DNA污染减少引物的用量优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸弥散原因解决方法PCRPCR中易出现的问题中易出现的问题靶序列或扩增产物的交叉污染操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 现象：空白对照出现目的扩增产物原因解决方法问题5：假阳性谢谢！9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。22.3.222.3.2Wednesday, March 02, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。*3/2/2022 11:47:27 PM11、人总是珍惜为得到。22.3.2*Mar-222-Mar-221