超氧化物歧化酶及其模拟化合物研究进展

1、文章编号:1006-7353(200401-0001(1-05超氧化物歧化酶及其模拟化合物研究进展丁书茂,杨 旭(华中师范大学生命科学学院,武汉 430079摘要:本文概述了不同种类的超氧化物歧化酶(Superox ide dismutase,SOD的结构、理化性质及其在生命活动中的意义,介绍了超氧化物歧化酶模拟化合物设计的基本原理及目前研究的现状,展望了SOD及其模拟化合物应用前景。关键词:超氧化物歧化酶;模拟化合物;配合物中图分类号:Q554 文献标识码:A现代医学界普遍认为:低浓度超氧阴离子自由基(O-2是维持生命所必需的,但是当它在体内浓度过高时,可引起机体组织细胞氧化损伤,导致机体发

2、生疾病,甚至死亡。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD是清除超氧阴离子自由基对细胞损害的一种重要的抗氧化酶,它可以预防和治疗由超氧阴离子自由基引起的多种疾病,如:抗炎症、抗肿瘤、抗辐射等。但SOD具有分子量大、半衰期短、不易透过细胞膜、临床应用易引起机体排异反应等特点,故其药用价值受到限制。超氧化物歧化酶模拟化合物(models of superoxide dismutase,M SOD是根据天然SOD活性部位的结构性质合成的,它在治疗由氧化损伤所导致的疾病方面将有非常广阔的应用前景。本文对SOD及其模拟化合物的结构、理化性质以及它们在生命活动中的应用作一概述。1.

3、超氧化物歧化酶1.1超氧化物歧化酶的发现及其分类1938年Mann和Keilin1,首次从牛红细胞中得到一种含铜蛋白 血铜蛋白。1969年M cCord和Fridovich2发现此蛋白能使超氧阴离子自由基O-2发生歧化反应:2O-2+2H+SOD酶O2+H2O2将其定名为超氧化物歧化酶(Superox ide dis mutase,SOD。SOD是需氧生物体内普遍存在的重要的抗活性氧毒害的酶。天然存在的SOD主要有五种,根据其活性中心金属离子不同可分为Cu-ZnSOD、M nSOD、FeSOD。Cu-ZnSOD主要存在于真核生物的胞浆中;Mn SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中;Fe

4、SOD主要存在于原核生物中。90年代,人们从链霉菌属又发现了Ni-SOD和Fe-ZnSOD,但其活性部位结构尚未确定。1.2超氧化物歧化酶的结构及其性质天然存在的SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性,即活性中心金属离子都是与三或四个组氨酸(H is、咪唑基(M n-SOD含一个天门冬氨酸羧基配位和一个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体收稿日期:2003-12-30基金项目:国家自然科学基金(批准号:39470632作者简介:丁书茂,男,硕士,讲师,从事生物化学与分子生物学研究。配位3。如:Cu-ZnSOD中,Cu2+处于四方锥环境中,分别与44位

5、、46位、61位和118位H is形成配位键,Zn2+处于四面体配位环境中,它与Cu2+共固H is-61的咪唑基而形成咪唑桥的结构。Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体,M n(是处于三角双锥配位环境中,其中一轴向配位为水分子,另一轴向被蛋白质辅基的配位H is-28占据,另三个配基H is-83、His-170和Asp -166位于赤道平面。Fe-SOD的活性中心是由3个H is、1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。现将三种SOD的结构及理化性质进行比较,如表1所示。表1:三种SOD的结构及理化性质比较结构及其理化性质Cu-ZnSOD Mn-SOD Fe-SOD 分子结构二

6、或四聚体二或四聚体二或四聚体分子量32kD、65kD42kD、85kD42kD、85kD 亚基分子量16kD23kD23kD金属含量1Cu:1Zn0.5-1M n0.5-1Fe颜色蓝绿色紫红色黄褐色氨基酸组成特点Tyr、Trp缺乏含Tyr、Trp含Tyr、Trp 特征吸收峰:紫外250nm280nm280nm可见光680nm475nm350nm分子构象主要为 -折叠主要为 -螺旋主要为 -螺旋KCN(1mol/L抑制否否H2O2(1mol/L抑制否抑制1.3超氧化物歧化酶的作用在正常的生理生化过程中,参与代谢的氧大多数与H+结合生成水,然而有2%左右的氧将被酶所催化形成超氧阴离子,超氧阴离子可

7、以转成过氧化氢,它们是生物体内活性氧的主要形式。超氧阴离子O2-是最常见的自由基,被认为是O2发生单电子还原的产物,它既带一个负电荷,又只有一个未成对的电子。在不同条件下,O2-既可作还原剂变成O2,又可作氧化剂变成H2O2。超氧阴离子自由基O2-容易进攻细胞膜、线粒体膜,与膜中的不饱和脂肪酸反应,造成脂质过氧化,进而破坏细胞结构,细胞内容物外溢,引起细胞溶胀坏死。研究表明,超氧阴离子自由基与许多疾病的形成和发展有密切关系4-7。此外超氧阴离子自由基还可通过H aber-Weiss反应,产生毒性更强的.OH。O2-+H2O2 O2+OH-+.OH超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O2

8、-,它使其发生歧化反应生成O2和H2O2;H2O2又在过氧氢酶(Catalase, CAT的作用下,生成H2O和O2。由此可见,有毒性的O2-在SOD和CAT共同作用下,变成了无毒的H2O和O2。1.4SOD的生命活动意义及其医学应用正常生命过程中产生的超氧阴离子自由基是维持生命所必需的,当其浓度过高时,对机体会造成损害。因此超氧化物歧化酶作为其特异清除剂,在生物体的生命活动中具有重要意义。大量研究表明,在衰老、炎症、肿瘤、放射病、自身免疫性疾病以及某些传染病中,超氧化物歧化酶的活性和含量的改变表现出相似规律,即随疾病发生、发展,人体内超氧化物歧化酶的活性及含量也逐步降低。随着疾病好转,超氧化

9、物歧化酶活性也逐步回到正常水平。因此,SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一8-12。目前,SOD 作为药用酶已经开始试用于治疗关节炎、红斑狼疮等疾病。SOD既可以作为药用酶,也可作为化妆品、保健食品的添加剂。科学家们研究发现,造成人体皮肤的松弛、长皱纹、老化的元凶是自由基,自由基攻击胶原系统,使结缔组织中的胶原蛋白变粗变短,皮肤失去膨胀力。SOD是超氧阴离子自由基的清除剂,因此,通过适当的途径,对机体补充外源SOD,能有效地防止和延缓上述过程的发生。目前, SOD已广泛应用于化妆品、保健食品中,如国内的化妆品大宝SOD、SOD复合酶美容霜、SOD蛇粉霜等。对SOD复合酶美容霜所作的临床研

10、究表明,SOD复合酶美容霜治疗皱纹有效率为88.68%,雀斑有效率为87. 80%,粉刺有效率为94.74%,色素沉着有效率为91.84%,总有效率为90.17%,与对照组比有明显差异。SOD作为食品添加剂加入的商品有SOD果汁饮料、SOD奶糖、SOD 口服液等。2.超氧化物歧化酶模拟化合物(MSOD目前,SOD大部分是从牛血、牛心或大肠杆菌中提取,其分离纯化手续繁杂,价格昂贵,而且在纯化及贮存过程中易失活。SOD 的分子量大,不易穿过细胞膜,在体内具有抗原性,因此SOD的应用受到限制。为此,生物无机化学家们合成和表征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD,期待将来能用小分子

11、模拟化合物代替SOD应用于临床。2.1超氧化物歧化酶模拟化合物的设计原理根据SOD的反应机理及其活性中心的结构特点而设计的模拟化合物,合成方法简便,成本低廉,纯度高,产率高且分子量小,水脂兼溶,易跨膜,活性高,用量少。所以,一些较理想的SOD模拟化合物可以很好地克服SOD本身的局限性。2.2超氧化物歧化酶模拟化合物的研究发展自从80年代初,Jippard SJ等13率先开展了SOD模拟化合物的研究工作以来,国内外许多学者参与了M SOD的研究工作,他们合成了许多SOD的模拟化合物,并发现这些化合物中,有些具有很好的SOD酶的活性。合成工作可分为3个层次:(1合成有类似SOD活性的简单配合物;(

12、2对SOD活性中心的模拟;(3整体模拟,即包含SOD的微环境的模拟。其中SOD活性中心的模拟最受重视。下面叙述SOD模拟化合物研究的进展情况。(1合成有类似SOD活性的简单配合物1973年,KluC-Roth D等人20-21在Cu2+溶液中加入甲酸盐、氨及一些氨基酸,发现溶液中生成的配合物对超氧阴离子自由基的歧化作用表现出相当可观的活性。之后,不少氨基酸、水杨酸、肽、阿司匹林等小分子的铜配合物都被注意到,它们都具有歧化O2-的活性,但较天然SOD活性低。90年代后,逐渐开展以天然SOD活性中心为指导并辅以较丰富的表征手段的模拟工作。(2以咪唑基为桥、双西佛碱为配体对SOD活性中心的模拟198

13、6年,Linss M等16人用1,4-二氨基丁烷和2-乙醛嘧啶合成了双Shiff碱Cu2+模拟物,其IC50值为1.4mol!L-1,SOD 活性达到天然酶的3%,比Cu(与氨基酸或水杨酸形成的配合物的SOD活性高60倍。罗勤慧等17报道的三种双Schiff碱铜配合物,它们的活性分别为天然SOD活性的0.5%、2.6%和10.7%。MuellerJ等18合成了Cu(PuPhePy,其单位催化活性和结构与Cu-ZnSOD非常接近,且稳定性高,上述双Schiff碱配合物中Cu2+均处于四方平面的配位环境中,类似于天然Cu-ZnSOD中Cu2+的键合状态,此类化合物可被视为初期较典型的对SOD活性中

14、心的模拟物。含苯并咪唑配合物被认为是一类新型的SOD模拟化合物,近年来廖展如等19-20合成并测定含苯并咪唑的5种配体及其32种分别含Cu(、Fe(、Mn(和Co(的模拟化合物,并用光谱、电化学手段等对其SOD活性进行了表征。研究表明,这些配合物具有明显的SOD活性,它们的IC50值为(10-6-10-9mol!L-1,催化歧化O-2的速度为(106-108mol!L-1!S-1,有些配合物具有抗肿瘤抗炎症等生物活性。他们综合单核及多核模拟化合物的结构及SOD活性信息,得出了一个很重要的结论:SOD模拟化合物的活性优劣取决于活性中心金属配位结构与天然SOD活性部位微环境的相似程度,与核的多寡无

15、关。结构愈相似,活性愈佳。(3大环类配合物对SOD活性中心的模拟以卟呤环为配体的大环类SOD模型化合物是另一类重要SOD的模型化合物。杜克大学的Moldovan L等21报道了一类含卟呤环的Mn(化合物,其中Mn(TM PyP在离体状态下的SOD活性,M nYMPy P歧化O-2的速度是SOD的0.2%左右。1997年Ines BH等22合成并表征了Mn2+ OBTM PyP和Cu2+OBTM Py两种以卟呤为配体的SOD模型化合物,他们的IC50分别为12nmol!L-1和0.88mol!L-1,SOD活性分别为天然SOD的11.0%和0.15%。含氮大环作为配体的各种模拟物也是当前研究的热

16、点之一。这类模拟物在活性上有些已达到甚至超过天然的SOD,在动物实验中也已取得理想的效果,可望成为新型抗炎药物。如:美国M etaPhore制药公司报道的M40403配合物,不仅有较高的SOD活性,而且在体内有很好的化学和生物稳定性。将其注入患有炎症或缺血再灌注损伤的老鼠体内可以防止组织损伤。当M40403被注入到老鼠体内后,它扩散到心脏、肺、大脑、肝脏和肾脏等器官而不发生任何分解反应。通过对M40403的代谢研究发现在体内不会因与NO、H2O2和OONO-发生作用而产生其他有毒物质,因而这种Mn-SOD模拟物具备药物应有的体内安全性。美国MetaPhore制药公司已完成M40403的首次临床

17、试验,并报道,经静脉注射给药,未见该药的剂量限制不良反应。MetaPhore正计划进行期临床试验,研究M40403和白介素-1联合用于晚期皮肤癌和末期肾癌病人的疗效23。3.MSOD应用和研究前景1969年美国化学家Rosenber C发现顺铂(Cis-DDP有很强的抗癌活性,开创了金属配合物抗癌研究的新领域。有人说20世纪90年代,药物研究最活跃的领域是金属配合物。目前,国内有些MSOD在进行临床前的应用,如:廖展如等研制的依据Cu-Zn SOD酶活性部位结构来设计的模拟化合物皮肤外用八百余例(浓度从几ppm到百分之几无毒副作用,小面积深度烫伤和度冻伤一周之内消肿止痛,使已脓肿的溃疡面愈合结

18、痂。这种SOD模拟化合物即使不能成为一种治疗外用药物,也可作为一种治疗冻疮或治关节炎的外用药或功能化妆品添加剂。在体外细胞筛选实验中表明23:M SOD 可以选择性作用和杀死癌细胞,而正常细胞在相同条件下不受或很少受伤害,可集抗肿瘤发生和抗癌于一种药物,因此,功能SOD 模拟化合物在治疗由氧化应激所导致的疾病方面有广泛的应用前景。低分子量的M SOD在治疗由氧化损伤所导致的疾病方面有非常广阔的前景,具有无免疫损伤、成本低、组织渗透性好、具有潜在的口服性以及体内更强的稳定性等优点,但目前模拟的化合物催化活力与天然酶相比普遍较低,模拟化合物的非特异性催化可能对生物体产生不良影响。其次,系统、全面表

19、征模型化合物的研究工作仍属薄弱环节,由于对天然SOD及模拟物的表征了解不全面,限制了对模拟物结构及影响催化活性诸因素的较全面的认识。超氧化物歧化酶的模拟属于新型交叉学科,需要化学和生物学知识乃至技术的高度结合,近三十年对于SOD模拟化合物的研究,已积累了大量的模拟化合物结构、光谱以及生物学和医学方面的信息。相信不久的将来,科学家们能合成具有更好SOD活性的MSOD,为进行生物学和医学试验,促进SOD 模拟化合物的产业化,为临床应用奠定基础。参考文献303.6049.成表征和活性J.华中师范大学学报(自然科学版,1991,25(3.4夏世钧,吴中亮.分子生理学基础M.武汉:湖北科学出版社,200

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23、tion of aqueous superox ide radicals w ith copper(co mplexesJphys,chem.,1976,80(6:588.16L inss M,Weser U,T he Di-schiff-base o f phridine-2-aldehy de and1,-4-diaminobu tane,a flex ible Cu(/Cu(chelator of siC nificant superox ide,dismutase,mimetic,activit y J,InorC chim Acta1986,125(2:117-121. 17L uo QH,Studies on simulation chemi stry o f Cu-Zn supero xide dismutaseJChem U niv,1997,18(7:1012-1018.18M