醛糖还原酶基因AR的克隆

1、.醛糖复原酶基因AR的克隆一、醛糖复原酶DNA模板的构建抽取人体血液，经过亲和色谱法提取mRNA，该过程可用商业化的试剂盒别离系统，得到高纯度mRNA。再用RT-PCR法，逆转录出c-DNA,再合成AR基因。二、引物设计登陆NCBI，进入“核酸中，输入醛糖复原酶的登陆码：U37100，找到该序列：1 CAAAAACAGC AACAGAAAGC AGGACGTGAG ACTTCTACCT GCTCACTCAG AATCATTTCT61 GCACCAACCA TGGCCACGTT TGTGGAGCTC AGTACCAAAG CCAAGATGCC CATTGTGGGC121 CTGGGCACTT G

2、GAAGTCTCC TCTCGGCAAA GTGAAAGAAG CAGTGAAGGT GGCCATTGAT181 GCAGGATATC GGCACATTGA CTGTGCCTAT GTCTATCAGA ATGAACATGA AGTGGGGGAA241 GCCATCCAAG AGAAGATCCA AGAGAAGGCT GTGAAGCGGG AGGACCTGTT CATCGTCAGC301 AAGTTGTGGC CCACTTTCTT TGAGAGACCC CTTGTGAGGA AAGCCTTTGA GAAGACCCTC361 AAGGACCTGA AGCTGAGCTA TCTGGACGTC TAT

3、CTTATTC ACTGGCCACA GGGATTCAAG421 TCTGGGGATG ACCTTTTCCC CAAAGATGAT AAAGGTAATG CCATCGGTGG AAAAGCAACG481 TTCTTGGATG CCTGGGAGGC CATGGAGGAG CTGGTGGATG AGGGGCTGGT GAAAGCCCTT541 GGGGTCTCCA ATTTCAGCCA CTTCCAGATC GAGAAGCTCT TGAACAAACC TGGACTGAAA601 TATAAACCAG TGACTAACCA GGTTGAGTGT CACCCATACC TCACGCAGGA GAAAC

4、TGATC661 CAGTACTGCC ACTCCAAGGG CATCACCGTT ACGGCCTACA GCCCCCTGGG CTCTCCGGAT721 AGACCTTGGG CCAAGCCAGA AGACCCTTCC CTGCTGGAGG ATCCCAAGAT TAAGGAGATT781 GCTGCAAAGC ACAAAAAAAC CGCAGCCCAG GTTCTGATCC GTTTCCATAT CCAGAGGAAT841 GTGATTGTCA TCCCCAAGTC TGTGACACCA GCACGCATTG TTGAGAACAT TCAGGTCTTT901 GACTTTAAAT TGAG

5、TGATGA GGAGATGGCA ACCATACTCA GCTTCAACAG AAACTGGAGG961 GCCTGTAACG TGTTGCAATC CTCTCATTTG GAAGACTATC CCTTCGATGC AGAATATTGA1021 GGTTGAATCT CCTGGTGAGA TTATACAGGA GATTCTCTTT CTTCGCTGAA GTGTGACTAC1081 CTCCACTCAT GTCCCATTTT AGCCAAGCTT ATTTAAGATC ACAGTGAACT TAGTCCTGTT1141 ATAGACGAGA ATCGAGGTGC TGTTTTAGAC ATT

6、TATTTCT GTATGTTCAA CTAGGATCAG1201 AATATCACAG AAAAGCATGG CTTGAATAAG GAAATGACAA TTTTTTCCAC TTATCTGATC1261 AGAACAAATG TTTATTAAGC ATCAGAAACT CTGCCAACAC TGAGGATGTA AAGATCAATA1321 AAAAAAATAA TAATCAT该段序列在70-1020bp可以合成蛋白质1、将上述数据导入到软件中Primer Premier2、根据起始密码子AUG和终止密码子(UAG、UGA、UAA)，点击“Find分别找出各位置：ATG：70、106、50

7、2、925TAG：1115TGA：1018TAA：1114选择起始密码为502，终止密码为1018.输入软件300bp到900bp选择如下片段5 TCGGCAAAGTGAAAGAAG 33 CTGATAGGGAAGCTACGT 5根据所选序列1431011选择酶切位点在1431011序列含有的酶切位点有在目的序列外的限制性内切酶有选择EcoR 和Xba 作为双酶切限制性内切酶，EcoRIGAATTCXbaITCTAGA那么上游引物序列：5 ATATGAATTCGAT-TCGGCAAAGTGAAAGAAG 3下游引物序列：5TGCTCTAGAT-TGCATCGAAGGGATAGTC 3三、PCR

8、扩增1、为了减少非靶序列的扩增，采用嵌套构造：即利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料。2、反响的dNTP的浓度要一致。3、反响的条件有：模板、引物、原料dNTP、耐热的DNA聚合酶Taq酶、Mg离子浓度、反响缓冲液BSA、PCR促进剂等。4、用琼脂糖凝胶电泳提纯扩增的DNA，在紫外灯下用刀片将目的区段切下来，放入DNA提取试剂盒中提纯。变性：温度为94摄氏度，时间为30秒退火：温度为52.9摄氏度延伸：温度为72摄氏度，时间为30秒循环次数：30次四、载体的选择选择Pcmv-n-His质粒pCMV-N-His是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达N端和His tag (H

9、is标签)融合的目的蛋白的表达质粒。含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；在多克隆位点的5端含有一个可以编码His标签的序列，因此可以表达出含有His标签的融合蛋白，可以方便地使用抗His的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测和别离纯化。质粒为卡那霉素抗性。转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。pCMV-N-His质粒中对于插入片断进展测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：    T3 primer(620639): 5AATTAACCCTCACTAAAGGG 3  

10、0; T7 primer(815-836): 5GTAATACGACTCACTATAGGGC 3   五、重组质粒的构建1、用限制性内切酶EcoR1、Xbal酶切Pcmv-n-His和AR基因。12 h后于75高温10 min灭活两种酶。反响条件由提供内切酶的公司提供2、用琼脂糖凝胶电泳法纯化酶切后的AR基因片段和Pcmv-n-His载体,再用DNA回收试剂盒回收。3、酶切后的AR基因及载体DNA浓度用分光光度法260nm测定，目的基因/载体基因 为 6/1或更高，加T4 DNA连接酶，于16连接过夜,构建成重组质粒。4、转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密