基于Staphylococcus_省略_缩酶在大肠杆菌合成稀有酮糖的研究_李子杰pdf

1、研究报告DOI: 10 13995 / j cnki 11 1802 / ts 201508002基于 Staphylococcus carnosus 来源的 D-果糖-1，6-二磷酸 醛缩酶在大肠杆菌合成稀有酮糖的研究*李子杰，贺贝贝，高晓冬( 江南大学 生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)摘要 将 Staphylococcus carnosus 来源的 FruAS. car 醛缩酶基因 fda 和大肠杆菌来源的 YqaB 磷酸酶基因 yqaB 分别插入到表达质粒 CDFDuet-1 得到重组质粒 CDF-fda-yqaB，并转化该重组质粒到大肠杆菌 B

2、L21Star( DE3) 。以同时过量表达 FruAS. car 醛缩酶和 YqaB 磷酸酶的大肠杆菌 BL21Star ( DE3) / CDFDuet-1-fda-yqaB 作为发酵菌株， 以葡萄糖为碳源通过糖酵解途径在胞内生成供体磷酸二羟基丙酮，分别在培养基中添加丙醛、丁醛为受体，进行 相应稀有酮糖的合成，从而成功地将羟醛缩合反应在大肠杆菌中实现，酮糖产物用 HPLC 检测并进行纯化和1 H NM 鉴定。最后，以13 C 同位素全标记的葡萄糖为碳源，添加丙醛为受体进行了同位素标记实验，证实了产物从DHAP 而来的 3 个碳原子最终来自葡萄糖。关键词醛缩酶; 磷酸酶; 稀有酮糖; 大肠杆

3、菌醛缩酶介导的羟醛缩合反应是合成手性 C-C 键1 3，的最重要方法之一。对于醛缩酶来说 磷酸二羟基丙酮( DHAP) 依赖型醛缩酶研究最为广泛。该类醛缩酶催化 DHAP 供体分子与醛受体分子的羟醛缩合反应，醛缩酶能够决定产物中两个新生成的立体中心的构型4，并且不受底物的结构或立体化学的影 响5。D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶( FruA) 活性高、能够以多种醛作为受体，是应用最为广泛的 DHAP 依赖型醛缩酶。FruA 对 DHAP 分子的专一性要求非常 高6，由于 DHAP 成本昂贵并且稳定性较差，不利于 产物的大量制备6 8。在前期工作中，基于“一釜四酶法”的策略，以外 消旋的 DL-3

4、-磷酸甘油作为起始底物在磷酸甘油氧 化酶的作用下生成 DHAP，同时与 FruAS. car 醛缩酶 ( Staphylococcus carnosus 来源) 催化的羟醛缩合反应，9偶联 制备了多种酮糖 。虽然能够避免直接使用DHAP，在一定程度上节约了成本，但没能从根本上 实现 DHAP 的大量合成问题。在本研究中，以便宜 的底物葡萄糖作为碳源，通过糖酵解途径在同时表达FruAS. car 醛缩酶和 YqaB 磷酸酶大肠杆菌工程菌胞内 产生 DHAP，并分别在培养基中添加醛受体丙醛、丁第一作者: 博士，副教授( 高晓冬教授为通讯作者，E-mail: xdgao jiangnan edu c

5、n) 。* 国家 自 然 科 学 基 金 ( 21302069 ) ; 中 国 博 士 后 科 学 基 金 ( 2014M551500)收稿日期: 2015 03 31，改回日期: 2015 05 12醛合成相应的稀有酮糖。1 材料与方法1. 1 质粒和菌株CDFDuet-1 质粒和大肠杆菌 BL21Star ( DE3 ) ，Novagen 公司; pKK-fda 质粒由 Fessner 教授提供; 大肠杆菌 MG1655 和 DH5 本实验室保存; 用于基因扩 增的引物在上海生工合成( 表 1) 。表 1本研究所用引物Table 1 Primers used in this study引物

6、序列CDF-fda-F5-GCGCGGATCCGAACCAAGAACAATT-3 ( BamHI)CDF-fda-5-GCGCCTGCAGTTAAGCTTTGTTTACTGAA-3( PstI)CDF-yqaB-F5-GCGCCATATGTACGAGCGTTATGCAGGTT-3( NdeI)CDF-yqaB-5-TATACTCGAGCAGCAAGCGAACATCCACG-3( XhoI)1. 2 酶、试剂和培养基DNA 聚合酶从 Invitrogen 公司购买; 限制性内切 酶和 T4 连接酶购于宝生物公司; 链霉素、M9 无机盐、 盐酸硫胺素购自 Sigma-Aldrich; 硅胶购自 E

7、MDChemicals 公司。LB 液体培养基( g / L) : 胰蛋白胨 10，酵母提取物5，NaCl 10，121 湿热灭菌 20 min; M9 培养基( g / L) :Na2 HPO4 6，KH2 PO4 3，NaCl 0. 5，NH4 Cl 1，MgSO4 0. 12， CaCl2 0. 011 1，硫胺素 0. 001，ZnSO4 0. 003 2。1. 3 CDF-fda-yqaB 重组质粒的构建以质粒 pKKfda 为模板，使用 CDF-fda-F 和 CDF-2015 年第 41 卷第 8 期( 总第 332 期) 7食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION

8、 INDUSTIESfda- 分别作为上下游引物通过 PC 扩增基因 fda;以大肠杆菌 MG1655 为模板，以 CDF-yqaB-F 和 CDF-yqaB- 分别作为上下游引物扩增基因 yqaB; 使用限制性内切酶 BamHI，PstI 分别对 fda 基因片段和 CDF-Duet-1 质粒进行双酶切、连接、转化 DH5，筛选阳性转化子，得到重组质粒 CDF-fda; 使用限制性内切酶NdeI，XhoI 分别对 yqaB 片段以及质粒 CDF-fda 进行双酶切，连接、转化、筛选阳性转化子，得到重组质粒CDF-fda-yqaB。1. 4 稀有酮糖的制备表达质粒 CDF-fda-yqaB 转

9、化 BL21Star( DE3) 感受态细胞得到 BL21Star( DE3) / CDF-fda-yqaB 重组菌株。将 LB 培养基中过夜培养的该重组菌株的培养液以 1 50 的比例转接到以 5 g / L 葡萄糖为碳源、链霉素终浓度为 100 g / mL 的 M9 培养基中( 2 L) ，在37 ，225 r / min 条件下培养。当测得菌液 OD600 为0. 8 1. 0 时，调整温度为 30 后，加入过滤灭菌终浓度为 1 mmol / L 的 IPTG。IPTG 诱导蛋白表达 2 3 h 后，加入终浓度为 30 mmol / L 丙醛( 过滤除菌) 。在发酵过程中，当葡萄糖或丙

10、醛的量不足时，适当补加，并用 NaOH 溶液来调节发酵液的 pH，使其维持在7. 0 左右。当在培养基中添加丁醛作为醛受体( 加入丁醛的终浓度为 40 mmol / L) ，发酵流程参考丙醛为醛受体的发酵。当产物的量没有显著增加时，结束发酵，整个发酵过程约为 40 h。1. 5 稀有酮糖的分离和纯化发酵结束后对发酵液进行离心( 4 000 g，20 min，4) ，将上清液转移到烧瓶中进行减压浓缩。浓缩产物用硅胶纯化，流动相为二氯甲烷 甲醇为20 1 ( v / v) ，流出液按照先后顺序进行依次收集，首先初步判定目的产物位于哪些离心管中，然后以二氯甲烷 甲醇 20 1( v / v)为展开剂

11、并以体外合成的相应酮糖产物作为对照，通过TLC 检测来确定含有目的产物的洗脱液。收集目标洗 脱液，浓缩、干燥、称重，用1 H-NM 检测纯度。1. 6 同位素标记实验将过夜培养的大肠杆菌菌液以 1 /50 的比例转接 到以 5 g / L 13 C 全标记葡萄糖作为碳源，链霉素终浓度为 100 g / mL 的 M9 培养基中( 100 mL) 。整个发酵过程参照 1. 4。当葡萄糖利用完全且产物的量没有显著变化时终止发酵。产物的分离纯化参照 1. 5， 并用13 C NM 检测。1. 7 分析方法HPLC 检测条件如下: 色谱柱型号为 Bio-adHPX-87H( 300 mm ×

12、 7. 8 mm，氢型阳离子交换柱) ，流动相为 5 mmol / L H2 SO4 ，流速为 0. 5 mL / min，柱温 为 60 ，示差检测器检测。2 结果和讨论2. 1 构建重组表达质粒 CDF-fda-yqaB首先验证重组质粒 CDF-fda 是否构建成功，通过BamHI，PstI 双酶切能够检测到 fda 基因( 888 bp) 大 小的片段 ( 图 1-a) ，表明 fda 基因片段已经插入到CDFDuet-1 质粒中并对 fda 基因进行测序。为了验证 表达质粒 CDF-fda-yqaB 是否构建成功，经过 BamHI，XhoI 双酶切能够检测到大约 1 600 bp 大小

13、的片段( 图 1-b) ，根据基因 fda 和 yqaB 的大小，可以推断yqaB 基因已经成功插入到质粒 CDF-fda 并进一步对yqaB 基因进行测序。1 DNA marker; 2 CDF-fda 质粒 BamHI，PstI 双酶切;3 DNA marker; 4 CDF-fda-yqaB 质粒 BamHI，XhoI 双酶切图 1 重组质粒 CDF-fda-yqaB 的构建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmidCDF-fda-yqaB2. 2 醛缩酶 FruAS. car 和磷酸酶 YqaB 在大肠杆菌中 的表达使用重组表达质粒 C

14、DF-fda-yqaB 在大肠杆菌BL21Star( DE3) 同时过量表达醛缩酶 FruAS. car 和磷酸 酶 YqaB。理论上，FruAS. car 和 YqaB 蛋白的分子质量 分别为 32. 855 kDa 和 20. 78 kDa。从 SDS-PAGE 图来看( 图 2) ，这两种蛋白的大小基本上与理论值一致，从而说明醛缩酶 FruAS. car 和磷酸酶 YqaB 成功得 到了表达。2. 3 以丙醛( 丁醛) 为醛受体发酵制备稀有酮糖在前期体外实验中，利用醛缩酶 FruAS. car 分别以 丙醛、丁醛等受体合成了 D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮 糖、D-苏式-5，6，7-

15、三脱氧-2-庚酮糖等稀有酮糖9。在体外实验中，酸性磷酸酶( AP) 常用来脱磷酸化得 到相应酮糖9，由于 AP 的最适 pH 偏酸性，不适合在82015 Vol. 41 No. 8 ( Total 332)1 蛋白 Marker; 2 未诱导全细胞; 3 诱导 10 h 后全细胞图 2 SDS-PAGE 检测 FruAS. car 和 YqaB 的表达Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression ofFruAS. car and YqaB大肠杆菌细胞内的脱磷酸化。通过查阅文献发现来源于大肠杆菌的磷酸酶 YqaB 在中性 pH( 生理条件 下) 具有较强的

16、磷酸酶活性10。首先在体外实验中研究 YqaB 磷酸酶对底物 D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖 1-磷酸的脱磷酸化作用，通过 TLC 检测发现该磷酸酶可以脱掉相应酮糖-1-磷酸的磷酸基团得到相应的酮糖( 未显示结果) 。为了在大肠杆菌合成如上两种稀有酮糖，以 BL21Star ( DE3) / CDF-fda-yqaB 作为发酵菌株，以廉价的葡萄糖作为碳源，分别在培养基中添加丙醛、丁醛作为醛受体，进行相应酮糖的合成。为了检测是否有目标酮糖产物的生成，对发酵液上清进行HPLC 检测，并分别以体外合成纯化的两种稀有酮糖 作为对照。由图 3

17、可以看到，D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖能够被检测到( 如箭头所示) ; 由图 4 可以看 到，D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖能够被检测到( 如 箭头所示) 。从而说明分别以丙醛、丁醛为受体，能 够分别在大肠杆菌中合成相应的稀有酮糖。当在培养基中添加丙醛作为醛受体，对于 2 L 的发酵，发酵上清液经过硅胶纯化，能够制备 D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖( 300 mg) ; 当在培养基中添加 丁醛作为醛受体( 2 L) ，发酵液经过纯化，能够制备D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖( 321 mg) 。纯化后的 酮糖产物用1 H NM 进行确认，如图 5 所示。总体上来

18、说，以丙醛、丁醛为醛受体的发酵，分离纯化后得到相应稀有酮糖的产量比较低，分析其可能的原因如下: 由 FruAS. car 醛缩酶体外合成实验可以推断，和 D-甘油醛相比，FruAS. car 醛缩酶对丙醛、丁醛的活性比较 低; YqaB 磷酸酶对 D-果糖-1-磷酸具有较高的磷酸酶研究报告图 3 HPLC 检测在大肠杆菌中合成 D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖Fig. 3 HPLC analysis of the production of 5，6-dideoxy-D-threo-2-hexulose in E. coli图 4 HPLC 检测在大肠杆菌中合成 D-苏式-5，6，7-三脱氧

19、-2-庚酮糖Fig. 4 HPLC analysis of the production of 5，6，7-trideoxy-D-threo-heptulose活性，而对 D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖-1-磷酸脱磷酸基团的活性比较低; 丙醛、丁醛对大肠杆菌菌体生长具有抑制作用。为了提高产量，一方面对调节 DHAP 合成的 上游基因过量表达，同时敲除 DHAP 的代谢支路在 胞内积累 DHAP 的量; 另一方面对发酵条件进行优 化，比如优化丙醛、丁醛加入的量等。2. 4 同位素标记实验经过羟醛缩合反应得到的稀有酮糖包含两部分， 第 1

20、，2，3 位的碳原子来源于供体 DHAP，其余碳原子来源于醛受体。为了证实产物从 DHAP 而来的 3 个碳原子最终从葡萄糖而来，以 BL21Star ( DE3) / CDF-fda-yqaB 作为工程菌，以13 C 同位素全标记的葡萄糖作为唯一碳源并在培养基中添加丙醛进行发酵。发酵结束后，经过分离纯化得到 D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖( 25 mg) 。通过对酮糖产物进行13 C NM 分析检测，可以得知产物的 1 位碳对应着位于 65 ppm位置的峰，产物的 2 位碳对应着位于 210 ppm 位置的峰，产物的 3 位碳对应着 76 ppm 位置的峰( 图 6) ，从而证明推断。

21、2015 年第 41 卷第 8 期( 总第 332 期) 9食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES图 5 纯化后产物1 H NM 鉴定Fig. 5 Characterization of products afterpurification by 1 H NM图 6 13 C NM 分析同位素标记的产物Fig.6 13C NM analysis of the product from the isotope experiment3 结论以过量表达 FruAS. car 醛缩酶和 YqaB 磷酸酶的大肠杆菌工程菌作为发酵菌株，以便宜的葡萄糖为碳源，通过糖酵解途

22、径在胞内产生 DHAP，分别在培养基中添加丙醛或丁醛作为受体，进行了相应稀有酮糖D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖和 D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖的合成，从而成功地将 FruA 醛缩酶催化的羟醛缩合反应在大肠杆菌中实现。具有重要意义的是在磷酸酶 YqaB 作用下，羟醛缩合产物能够在胞内实现脱磷酸生成没有磷酸基团的酮糖，有利于产物穿过细胞膜进入到胞外，便于分离和纯化，同时实现了磷酸基团在胞内的再次利用。然而由于酮糖产量相对较低，拟采用分子生物学的方法提高胞内 DHAP水平和优化发酵条件来提高产量。此外，同位素标记实验证实了酮糖产物从 DHAP 而来的 3 个碳原子最终是从葡萄糖而来

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