实验二沙门氏菌之检测

1、實驗二:沙門氏菌之檢測 一意義: 沙門氏菌為G(-)桿菌，除Salmonella pullorma及S.gallinarium外，均帶週鞭毛具運動性，一般不具莢膜。在水中耐寒，且對煌綠(Brilliant green)四硫酸諷(Sodium tetrathionate)及膽酸諷(Sodium deoxycholate)有耐性，所以這些藥劑常用來選擇性培養沙門氏菌。沙門氏菌中毒原因係因攝食感染此菌得肉類蛋類乳類或氮白質含量高的食品而引起中毒，係感染性中毒，當檢驗食品中此菌感染量達105-108 CFU/g，即可能致病。檢驗食品中是否含有此菌的步驟有: (一)增菌培養:將樣品置於Lactose b

2、roth或Buffered peptone water中，使菌量增加以利檢驗之進行，其目地為使已受傷致活性降低之菌體能予以復活恢復。由於此兩種培養基是屬於非選擇性之復活培養基，雖適用於多數食品，但當由大量G(+)菌如乳鏈球菌(Streptococcus lactis)存在時易發生干擾現象，可在培養基中添加0.002% (W/V)煌綠(brilliant green)或0.004%結晶紫以克服此干擾現象。 (二)選擇性增殖:利用亞 酸鹽胱胺酸肉羹(Selenite cystine broth)及四硫代硫酸鹽肉羹(Tetrathonate broth)來抑制大腸桿菌等雜菌，使沙門氏菌能被選擇性增殖

3、。 Tetrathonate broth:本培養基之選擇效果是在硫代硫酸鈉(Na2S2O35H2O)與碘之反應所生成的Tetrathionate作用。沙門氏菌具有還原Tetrathionate性質，該還原物質為本菌之能源而促進發育。相反地，E.coli之增殖反受到抑制，而Brilliant Green及去氧膽酸鈉更阻礙E.coli發育。 (三)選擇性的平面培養(分離培養):利用煌綠瓊脂培養基(Brilliant green agar)，沙門氏桿菌-赤痢菌瓊脂培養基(Salmonella-Shigella agar，SS agar)及亞硫酸珌瓊脂培養基(Bismuth sulfite agar)

4、劃線培養及使單獨菌落產生，並利用沙門氏菌在這些培養基產生菌落的顏色及外觀來挑出可疑沙門氏桿菌，再利用斜面劃線穿刺法，將可疑的菌接種於三鐵糖培養基(TSIA)及離胺酸培養基(LIA)，觀察可疑菌落在這斜面及斜面下的顏色變化來做鑑定。 Brilliant green agar:本培養基之抑制劑為煌綠，診斷系統係依據乳糖與蔗糖之發酵，於沙門氏菌存在下，由於其無法發酵乳糖與蔗糖，培養基會呈現淺紅色，並且在紅色背景下菌落會呈紅色，易於辨認。 SS agar:膽酸鹽的主成份去氧膽酸鹽(desoxycholate)與Brilliant green對G(+)的發育有抑制作用，而檸檬酸鈉與硫代硫酸鈉的相乘作用可

5、抑制大腸菌發育，而乳糖的分解所產生的酸，致使膽酸析出中性紅沉澱，中性紅與膽酸結合之一連續反應，因此形成紅色-磚色的混濁菌落，另一方面，由硫代硫酸鈉所產生的硫化氫與檸檬酸鐵結合，生成硫化鐵而變黑色。 Bismuth sulfite agar:本培養基以亞硫酸矽可抑制G(+)亞硫酸鈉及煌綠為抑制劑，診斷系統係依據於可發酵糖類(本培養基為葡萄糖)存在下，使亞硫酸鹽還原為硫化物而成黑色菌落。 (四)純化:將(三)斜面劃線穿刺培養出現典型反應的菌株轉接到Mac Conkey Agar及Brilliant green agar上劃線培養，並挑出典型菌落，即為純化菌種，將此菌再接種至TSIA上進一步確認其結

6、果。 (五)尿素酵素血清學及生化試驗:將(四)TSIA之菌落轉接在尿素肉羹(Urea broth)離胺酸脫酸肉羹 (Lysine decarboxylase broth) 酚紅碳水化物肉羹氯化鉀肉羹丙二酸鹽肉羹胰化蛋白肉羹 (Indole test) 葡萄糖肉羹(MR-VP test)辛蒙斯氏檸檬酸瓊脂(測試菌種是否含有citrate lyase，可將citrate分解利用，如果可分解citrate，使培養基變鹼性而呈藍色)酚紅乳酸肉羹酚紅蔗糖肉羹中並觀察其生化反應。二使用藥品與培養基 樣品及培養基 接種日期 備註 1.檢驗樣品 第一天( / ) 2.Lactose broth 第一天( /

7、) 每組一管 3.Selenite cystine broth 第二天( / ) 每組一管 4.Tetrathionate broth 第二天( / ) 每組一管 5.Brilliant green agar 第三天( / ) 每組一平板 6.SS agar 第三天( / ) 每組一平板 7.Bismuth sulfite agar 第三天( / ) 每組一平板 8.Triple sugar iron agar(TSIA) 第四天( / ) 每組二斜面 9.Lysine iron agar(LIA) 第四天( / ) 每組二斜面 10.Mac Conkey agar 第五天( / ) 每組一平

8、板 11.Brilliant green agar 第五天( / ) 每組一平板 12.TSIA 第六天( / ) 每組一斜面 13.Urea broth(過濾除菌) 第七天( / ) 每組一管1.5-3ml 14.Lysine decarboxylase broth 第七天( / ) 每組一管 15.Phenol red dulcitol broth 第七天( / ) 每組一管 16.Potassium cyanide broth 第七天( / ) 每組一管 17.Malonate broth 第七天( / ) 每組一管 18.Tryptone broth 第七天( / ) 每組一管 19.

9、Glucose broth(MR-VP broth) 第七天( / ) 每組一管 20.Simmon'citrate agar 第七天( / ) 每組一管 21.Phenol red lactose broth 第七天( / ) 每組一管 22.Phenol red sucrose broth 第七天( / ) 每組一管 備註:(3)Selenite cystine broth:將各成份混合分裝10ml試管後，在沸水加熱10 分鐘後，當天使用(不可高溫殺菌) (Brilliant green dye) (5)BGA在注入平板前須先混合均勻(但搖動時避免氣泡) (8)TSIA取5ml裝入

10、試管殺菌後，裝斜面長4-5cm，底深2-3cm (9)取4ml LIA裝入試管，殺菌後製成斜面長3cm，斜面底深度，斜面底深度1.5-3cm. 二各培養基名稱作用及沙門氏菌之典型反應 培養基名稱 作 用 典型菌落或反應 1.Lactose broth 菌種擴大培養 2.Selenite cystine broth 抑制雜菌 3.Tetrathionate broth 抑制雜菌 4.Brilliant green agar 抑制雜菌並產生典型反應 透明周圍粉紅菌落 5.SS agar 抑制雜菌並產生典型反應 粉紅白色不透明菌落 6.Bismuth sulfite agar 抑制雜菌並產生典型反應

11、 褐色黑色(有些綠色) 7.Triple sugar iron agar (TSIA) 好氣下利用糖則斜面變黃 斜面為紅(不變色) 嫌氣下利用糖則底部變黃 底部變黃色 產生H2S則H2S與Fe作用 變或不變黑色皆有可能產生黑色FeS 8.Lysine iron agar(LIA) 斜面維持紫色 底部維持紫色 變黑或不變黑皆有可能 9.Mac Conkey agar 純化並產生典型菌落 無色透明菌落 10.Brilliant green agar 純化並產生典型菌落 白或粉紅;透明或不透明菌落 11.TSIA 12.Urea broth(桔紅色) 若產生尿素 則培養基由 桔紅色(-) 桔紅色變紫

12、色 13.Lysine decarboxylase broth 厭氧下離胺酸脫 則仍 紫色 (紫色) 維持紫色 否則變黃色 14.Phenol red dulcitol broth 若使用dulcitol則培養基 (紅色) 黃色或產氣(+) 變酸而變黃色 15.Potassium cyanide broth 利用KCN則培養基由清澈變 清澈(-) 混濁 16.Malonate broth(綠色) 若利用Malonate則培養基由 綠色(-) 綠變藍 17.Tryptone broth 培養後加入柯瓦克試劑，上未產生紅色(-) 層於幾分鐘後形成紅色為產生Indole 18.Glucose bro

13、th(MR-VP broth) VP test呈粉色為正反應 不呈粉紅色(-) MR test呈紅色為正反應 變紅色(+) 19.Simmon'citrate agar(綠色) 有菌生長，且培養基由綠色變藍色(+) 變藍色為正反應 20.Phenol red lactose broth 若利用lactose則培養基變黃色 紅色(-) 21.Phenol red sucrose broth 若利用sucrose則培養基變黃色 黃色(+) 沙門氏菌之檢測實驗紀錄紙 組別: 姓名: 日 期 實 驗 內 容 與 結 果 簽 名 第一天( / ) 第二天( / ) 第三天( / ) 第四天( /

14、 ) 菌落在Brilliantgreen agar 顏色 : 上的型態 組織 : 表面 : 邊緣 : 菌落在SS agar上的型態 顏色 : 組織 : 表面 : 邊緣 : 菌落在Bismuth agar上的 顏色 : 型態 組織 : 表面 : 邊緣 : 第五天( / ) 菌落在TSIA上的型態 斜面顏色: 底部顏色: 有無變成黑色: 菌落在LIA上的型態 斜面顏色: 底部顏色: 有無變成黑色: 第六天( / ) 菌落在MAC Conkey 顏色 : green agar上的型態 組織 : 表面 : 邊緣 : 第七天( / ) 菌落在TSIA上的型態 斜面顏色: 底部顏色: 有無變成黑色: 第八

15、天( / ) 尿素 試驗 顏色(+/-): Indole test 顏色(+/-): 第九天( / ) 丙二酸利用性 顏色(+/-): VP test 顏色(+/-): 酚紅(Ducitol) 顏色(+/-): 酚紅(Lactose) 顏色(+/-): 酚紅(Sucrose) 顏色(+/-): 第十一天( / )離胺酸(脫 ) 顏色(+/-): MR test 顏色(+/-): 檸檬酸鹽 顏色(+/-): Salmonella實驗配藥單(每班用量) 預定使用時間1.Lactose broth 2.75g /200ml加熱後溶解分裝入5ml/支121,15滅菌2.無菌空試管螺旋試管121,15滅

16、菌3.1ml pipette7支/桶170,2小時滅菌4.SS agar 18.9g / 300ml加熱溶解倒成20個plate後備用(不可高溫滅菌,當日配製)5.Bismuth sulfite agar 15.6g / 300ml加熱溶解倒成20個plate後備用(不可高溫滅菌,當日配製)6.Triple Sugar Iron agar 11.89g /200ml加熱溶解後分裝入5ml/支121,15滅菌做成斜面7.Lysine iron agar(LIA)6.90g /200ml加熱溶解後分裝入5ml/支121,15滅菌做成斜面8. Mac Conkey agar15.0g / 300ml

17、121,15滅菌倒成20個plate後備用9. Urea broth 過濾除菌(使用前一日下午配)1.94g/ 50ml加熱溶解過濾除菌分裝入3ml/支後備用配製前需事先準備16支無菌試管10. Lysine decarboxylase broth1.12g /80ml加熱溶解後分裝入5ml/支121,15滅菌11. Malonate broth0.4g /50ml加熱溶解後分裝入3ml/支121,15滅菌12. Tryptone broth (此次不做)0.5g /50ml加熱溶解後分裝入3ml/支121,15滅菌13.MR-VP broth (此次不做)1.7g /100ml加熱溶解後分裝入5ml/支121,15滅菌14.Simmons citrate agar2.42g/100ml加熱溶解後分裝入5ml/