抗霉菌性阴道病三种中药复方体外对白色念珠菌生物膜形成的影响

1、抗霉菌性阴道病三种中药复方体外对白色念珠菌生物膜形成的影响         10-08-23 14:28:00     编辑：studa20                   作者：官妍 汪长中 沈非 吴泓 王艳 云云【摘要】  目的观察3种中药复方体外对白色念珠菌生物膜形成的影响。方法

2、采用结晶紫染色法和MTT 法评价白色念珠菌生物膜的体外生长动力学, 微量稀释法检测3种中药复方对白色念珠菌悬浮菌及其生物膜的抑制作用以及药物包被对白色念珠菌生物膜形成作用。结果生物膜内白色念珠菌数量随培养时间延长而增加。3种中药复方对白色念珠菌悬浮菌的最低抑菌浓度50%(MIC50)分别为3.255,3.565,3.875 mg/ml,对生物膜的SMIC50与SMIC80分别是3.255，6.51，3.565，7.12 mg/ml，3.875，7.623 mg/ml。3种中药复方包被浓度分别在7.882，3.808，6.357 mg/ml以上时对其生物膜形成的抑制作用有显著性。结论3种中药复方

3、对体外白色念珠菌生物膜具有明显的抑制作用。 【关键词】  中药复方; 白色念珠菌; 生物膜    近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂等的被广泛使用，白色念珠菌等真菌引起的感染机会显著增多。白色念珠菌等真菌耐药菌株不断出现，针对生物膜相关感染难治性、易复发，现有抗真菌药物较少并具较强毒副作用等问题，必须寻找出更好的药物和方法抗真菌及相关生物膜感染。目前中草药治疗真菌感染有不少报道,曾有文献称对862种中草药(动物药15种,矿物药13种,植物药834种) 进行了抗白色念珠菌的活性筛选,其中有初步活性的103种(11.7%)1。但有关中草药对念珠菌

4、生物膜的影响报道较少。本研究从文献、临床收集了对霉菌性阴道炎有较明显作用的中草药复方3种,进行体外抗白色念珠菌生物膜作用的实验2,探讨这些中药复方对体外念珠菌生物膜形成的影响, 旨在为解决念珠菌感染性疾病易复发、易产生耐药性提供新的途径。1  材料与仪器1.1  菌株白色念珠菌标准菌株ATCC10231，购于合肥市疾病控制中心。1.2  药物3种中药复方。    复方1(坐浴剂，安徽中医学院附属第一医院妇科组方):苦参10 g,百部30 g,野菊花30 g,蛇床子50 g,土槿皮30 g,公丁香10 g,黄柏50 g。 &#

5、160;  复方2(灭霉灵擦洗剂)3:茜草30 g,黄连20 g,黄柏20 g,苦参20 g,虎杖30  g,蛇床子10 g,艾叶10 g,白鲜皮10 g,土槿皮10 g,丁香9 g,百部30 g,苍术15 g,藿香15  g,黄精20 g,枯矾9 g。    复方3(坐浴剂)4:萆薢12 g,薏苡仁15 g,土茯苓30 g,藿香15 g,白矾30 g,薄荷5 g。    以上3种中药复方均购于安徽中医学院附属第一医院中药房,并经鉴定。每方均经水浸泡30 min后,常规水煎,药物浓度均调至每毫升含1 g生

6、药。1.3  培养基RPMI1640培养基(GIBCO公司),YPD培养基依据文献5配制。1.4  试剂结晶紫( 天津市光复精细化工研究所),四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma 公司),二甲基亚砜(DMSO,上海金山化工厂) 。1.5  检测仪器318-酶标仪(上海),96 孔微量培养板(杭州生友生物技术有限公司)。2  方法2.1  白色念珠菌生长动力学的检测5，6将浓度1×106个细胞/ml的菌液100 l接种于96孔微量培养板中,37培养,分别于接种后2，4，6，8，24，48 h,弃去培养基, 用PBS(pH 7.2)洗去未黏

7、附菌。用结晶紫染色法7测定白色念珠菌生物量(biomass):将1%结晶紫100 l加入孔内,37孵育20 min,PBS洗3遍,酶标仪490 nm 波长下检测吸光度。2.2  3种中药复方对悬浮白色念珠菌MIC的测定 依据NCCLS 的M27-A方案8,先按二倍稀释将药物100 l加到96孔板中,再加入0.5×1032.5×103/ml菌体的混悬液100 l,37培养48 h,以无菌生长的最小药物稀释度作为各菌株的最低抑菌浓度(MIC) 。2.3  3种中药复方对白色念珠菌生物膜MIC( SMIC)的测定9将白色念珠菌接种于YPD 培养基中,37摇床过

8、夜培养,收集菌体,用RPMI1640培养基稀释,调整菌液浓度为1×106/ml。将100 l该96 孔板中,37培养24 h,使白色念珠菌完全黏附于平底的96孔板基底表面,形成念珠菌生物膜的结构。生物膜形成后,弃去培养基及悬浮菌,用PBS洗3次,将药物按两倍稀释加到各孔中,继续培养48 h。MTT法检测抑制生物膜50%( SMIC50) 及80%( SMIC80) 的药物浓度:即50 l的MTT 溶液( 贮存液含5 mg/ml PBS,临用前用预温的0.15 M PBS 按15 稀释)加入每孔中, 37孵育5 h。弃去含MTT的培养基,PBS洗3遍,加入DMSO100 l,振荡5 min,在酶标仪490 nm波长下检测吸光度。2.4  3种中药复方预处理96孔板10用无菌的PBS将五种中药复方分别按二倍连续稀释成7个浓度梯度: 100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56 mg/ml, 200 l/孔,4过夜。吸弃药物,PBS洗1遍,每