大肠杆菌对恩诺沙星耐药性研究

1、大肠杆菌对恩诺沙星耐药性研究    英文题名 Studies on Persistence of E.coli to Enrofloxacin  关键词 大肠杆菌; 耐药性; 抗药性; 外排泵; SOS应答; 英文关键词 Escherichia coli; persistence; resistance; SOS reaction mechanism; efflux pump; 中文摘要 细菌对抗菌药物产生抗药性是兽医临床的常见现象,检测临床分离细菌的抗药性可及时掌握细菌的抗药趋势,研究细菌抗药机制可以为新药物的开发及合理用药提供理论支持。 本

2、文检测了山东地区大肠杆菌药敏情况并改进了药敏试验方法,建立了测定MPC的坡面平板法,研究了大肠杆菌对恩诺沙星的耐药机制。 利用96点阵药敏检测盒检测山东地区禽源和猪源大肠杆菌的抗药性结果显示：大肠杆菌呈现严重的多重抗药性,多抗耐药率超过90%,禽源性大肠杆菌抗药性明显高于猪源性大肠杆菌。 建立了坡面平板法,结果显示坡面平板上的药物浓度呈良好的梯度分布,可以把对药物敏感性不同的细菌区分开。研究坡面平板上大肠杆菌的性质,发现高浓度药物下生长大肠杆菌发生了基因突变,而低浓度药物下生长的没有发生基因突变。 利用基因芯片和实时荧光定量PCR研究恩诺沙星对大肠杆菌全基因表达谱的影响,结果显示：(1)恩诺沙

3、星作用5h后,大肠杆菌519个基因出现表达差异,外排泵基因表达水平提高,外膜蛋白基因表达量急剧减少,恩诺沙星的靶酶parC基因表达量增加。说明细菌生理机制发生了广泛而复杂的变化。(2)处理菌株的恩诺沙星靶酶没有基因突变,提示低水平的细. 英文摘要 Resistance to antibiotic is inevitable for bacterium, we can know the resistance tendency of bacterium in time by testing drug sensitivity of pathogenic from clinical, it can&#

4、160; 摘要 4-5 Abstract 5 第一部分 文献综述 11-23     1 大肠杆菌耐药性现状 11-13     2 细菌耐药性机理研究进展 13-16         2.1 抗菌药物作用靶位改变 13-14         2.2 产生灭活酶 14         2.3 改变细菌外膜通透性 14-15 &#

5、160;       2.4 影响主动外排系统 15         2.5 形成细菌生物膜 15-16         2.6 细菌形态的变化 16     3 防突变浓度与突变选择窗理论 16-18         3.1 MPC定义 16-18     

6、    3.2 MSW与MIC理论的区别 18     4 外排泵抑制剂 18-21         4.1 干扰外排泵组装的外排泵抑制剂 19         4.2 阻断外排泵能量来源的外排泵抑制剂 19-20         4.3 阻碍底物通过外排泵通道的外排泵抑制剂 20     

7、;    4.4 机制未知的外排泵抑制剂 20-21     5 研究目的和意义 21-23 第二部分 大肠杆菌的药敏试验 23-34     试验一 山东地区动物源大肠杆菌药敏检测 24-30         1 材料与方法 24-26             1.1 试验材料 24-25    

8、         1.2 大肠杆菌的分离鉴定 25             1.3 药敏试验 25-26         2 结果与分析 26-28             2.1 禽源大肠杆菌药敏检测结果 26-27  

9、;           2.2 猪源大肠杆菌药敏结果 27-28         3 讨论 28-29         4 小结 29-30     试验二 吸管药敏检测盒的研制 30-34         1 材料与方法 30-32   

10、          1.1 材料 30             1.2 制备检测盒 30-31             1.3 检测盒的使用 31-32             1

11、.4 检测盒效果验证 32         2 结果与分析 32-33         3 讨论 33         4 小结 33-34 第三部分 大肠杆菌对恩诺沙星耐药机理研究 34-71     试验一 坡面平板法的建立 35-43         1 材料与方法 35-37 &#

12、160;           1.1 材料 35             1.2 制定标准曲线 35-36             1.3 配制琼脂块 36           &

13、#160; 1.4 配制坡面平板 36             1.5 坡面平板各位置浓度分布与时间的关系 36             1.6 测定扩散浓度与配制浓度之间的关系 36-37             1.7 测定琼脂块中药物回收率 37  &#

14、160;          1.8 坡面平板验证 37         2 结果与分析 37-41             2.1 标准曲线 37             2.2 坡面平板表面药物浓度 37-39

15、60;           2.3 不同配制浓度坡面平板表面药物浓度 39-41             2.4 琼脂中药物回收率 41             2.5 坡面平板使用效果 41        

16、3 讨论 41-42         4 小结 42-43     试验二 坡面平板上大肠杆菌性质的研究 43-47         1 材料与方法 43-44             1.1 试验材料 43          &

17、#160;  1.2 配制坡面平板 43             1.3 细菌处理 43             1.4 扩增喹诺酮耐药决定区 43-44         2 结果与分析 44-46         3 讨论 46

18、         4 小结 46-47     试验三 恩诺沙星对大肠杆菌基因组表达谱的影响 47-60         1 材料与方法 47-50             1.1 供试菌种 47           &

19、#160; 1.2 表达谱基因芯片 47             1.3 主要试剂与仪器 47-48             1.4 大肠杆菌生长曲线的测定与形态观察 48             1.5 细菌总RNA提取 48    &#

20、160;        1.6 样品RNA标记 48             1.7 杂交与清洗 48-49             1.8 芯片扫描与图像采集 49             1.9

21、基因突变分析 49-50             1.10 数据分析 50         2 结果 50-56             2.1 大肠杆菌生长状态 50-51            

22、2.2 总RNA电泳鉴定 51-52             2.3 表达谱基因芯片杂交与图像采集 52             2.4 差异基因筛选 52-56             2.5 基因序列比对结果 56     &

23、#160;   3 讨论 56-59             3.1 基因谱表达 56-59             3.2 基因序列比对 59         4 小结 59-60     试验四 荧光定量测定大肠杆菌基因表达量 60-66  &#

24、160;      1 材料与方法 60-62             1.1 试验仪器 60-61             1.2 细菌处理 61             1.3 提取供试大肠杆菌总RNA 61

25、60;           1.4 荧光定量PCR 61-62             1.5 结果处理 62         2 结果与分析 62-64             2.1 扩增曲线 62-63

26、            2.2 熔解曲线 63             2.3 基因数量 63-64         3 讨论 64-65         4 小结 65-66     试验五 外排泵与耐药性的

27、关系 66-71         1 材料与方法 66-68             1.1 供试菌株 66             1.2 试验器材 66-67             1.3 试剂

28、配制 67             1.4 测定菌体内恩诺沙星达到稳态的时间 67             1.5 外排泵检测 67-68         2 试验结果 68-69           

29、0; 2.1 菌体内药物达到稳态所需时间 68             2.2 细菌外排泵检测结果 68-69         3 讨论 69-70         4 小结 70-71 结论 71-72 参考文献 72-82           &

30、#160; 1.2 试验器材 66-67             1.3 试剂配制 67             1.4 测定菌体内恩诺沙星达到稳态的时间 67             1.5 外排泵检测 67-68     &#

31、160;   2 试验结果 68-69             2.1 菌体内药物达到稳态所需时间 68             2.2 细菌外排泵检测结果 68-69         3 讨论 69-70        

32、; 4 小结 70-71 结论 71-72 参考文献 72-82             1.2 试验器材 66-67             1.3 试剂配制 67             1.4 测定菌体内恩诺沙星达到稳态的时间 67   

33、60;         1.5 外排泵检测 67-68         2 试验结果 68-69             2.1 菌体内药物达到稳态所需时间 68             2.2 细菌外排泵检测结果 68-69 &

34、#160;       3 讨论 69-70         4 小结 70-71 结论 71-72 参考文献 72-82             1.2 试验器材 66-67             1.3 试剂配制 67   

35、          1.4 测定菌体内恩诺沙星达到稳态的时间 67             1.5 外排泵检测 67-68         2 试验结果 68-69             2.1 菌体内药物达到稳态所需

36、时间 68             2.2 细菌外排泵检测结果 68-69         3 讨论 69-70         4 小结 70-71 结论 71-72 参考文献 72-82             1.2 试验器材 66-

37、67             1.3 试剂配制 67             1.4 测定菌体内恩诺沙星达到稳态的时间 67             1.5 外排泵检测 67-68         2

38、 试验结果 68-69             2.1 菌体内药物达到稳态所需时间 68             2.2 细菌外排泵检测结果 68-69         3 讨论 69-70         4 小结 70-71 结论 71-72 参考文献 72-82             1.2 试验器材 66-67     &