石榴叶乙醇水提取物的抑菌杀虫活性研究修改建议王庆忠

1、石榴叶乙醇水提取物的抑菌杀虫活性研究王东方 谷鹏 柏显首 王庆忠 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室（潍坊学院生物与农业工程学院）,山东,潍坊,261061)（潍坊学院 生物与农业工程学院，山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室， 山东 潍坊 261061）摘要 用索氏提取法以用乙醇水加热提取石榴叶的有效成分，并对提取物的对细菌的抑菌作用和及对果蝇与和槐蚜触杀活性药理作用活性进行了初步探究。结果表明，石榴叶提取物对革兰氏阳性菌（白色葡萄球菌）有明显抑制作用，其有效抑菌浓度值为40mg/mL ；对果蝇的药理作用明显，数据变化显著，有上升趋势；对槐蚜药理作用有明显的触杀活性，其LC50为1

2、0.4203mg/mL。因此，石榴叶提取物对革兰氏阳性菌及昆虫有良好的的抑菌杀虫效果。关键字 石榴叶；提取物；生物活性；细菌；果蝇中图分类号 S482.1 文献标识码 AThe Study of the Ethanol Antimicrobial, Insecticidal Biological Activity of the Ethanol and Water Extract of Pomegranate LeafWang Dongfang, Gu Peng, Bai Xianshou, Wang QingzhongKey Laboratory of biochemistry and mol

3、ecular biology in university of Shandong province (College of bio-engineering and agriculture, Weifang university), Shandong, Weifang, 261061abstract In present study, theAn active ingredient was of the extracted fron of pomegranate leaf extracted by Soxhlet extraction method with ethanol and water

4、solution accompanied by with heatinged, and preliminary study of the extract that can interacted bacteria bacteriostatic action and the activity of the drosophilas and the Cassia aphids pharmacological role initial inquiry. The results showed that pomegranate leaf extract have significantly suppress

5、 of Gram-positive bacteria (Staphylococcus albus),the effective inhibitory concentration value of 40mg/ml; and it has obviously pharmacological on Drosophila with data changes, and rising;With pharmacological effects Cassia aphids value , its LC50 is 10.4203mg/mL. Therefore, the pomegranate leaf ext

6、ract is good antibacterial insecticidal effect on gram-positive bacteria and insect.Key words pomegranate leaf; extract; biological activity ; Bacterial; drosophilas石榴叶为石榴科植物石榴(punica granatun L)的叶。石榴叶具有收敛止泻、解毒杀虫功效，主治泄泻、痘风疮、癞疮、跌打损伤，在埃及作为传统的药材。以前的研究表明，科学研究者对石榴叶化学成分进行了许多研究，取得了较大进展，其药理活性也日益明确。从石榴叶中含有已分

7、离到20多种化合物，其中包括熊果酸、白果酸、白桦脂酸、甘露醇 、菟资单宁、鞣花单宁以及黄酮苷类等化合物1。 已有研究表明石榴叶水浸剂能显著增强大鼠胃蛋白酶活性，促进胆汁分泌，并可以加强大鼠小肠蠕动；能显著抑制大鼠胃液分泌和总酸排出量2。研究还观察到石榴叶水浸剂对大鼠试验性胃溃疡的作用，发现石榴叶水浸剂可显著降低大鼠胃溃疡发生率，并减少胃溃疡面积和降低胃溃疡程度。石榴叶水提取物在调节血脂、清除氧自由基等方面也有活性，具有调脂作用的活性部位石榴叶鞣质，在体外试验中，石榴叶鞣质能明显抑制还原酶活性，石榴叶鞣质的效价较辛伐他汀强100倍左右，同时也提示了石榴叶鞣质降低胆固醇的作用机制，部分与抑制该酶活

8、性有关3；鞣质能凝固微生物体的原生质及多种酶，因而对各种细菌和真菌有抑制作用。临床研究已经证实石榴皮对淋球菌有明显的抑制作用。4本实验用乙醇水提取石榴叶的有效成分，然后用提取液对细菌进行抑菌试验和果蝇毒理实验，统计和分析实验所得数据，最终得到试验结果。1 材料和方法1.1 材料与仪器试剂材料来源：石榴叶采集于潍坊学院校园内；大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和白色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）菌株取自潍坊学院生物与农业工程学院微生物实验室，菌种斜面培养进行繁殖；成年雌雄黑腹果蝇取自遗传实验室，后在微生物实验室内扩代培养了；槐蚜采集于潍坊学院校内。主要仪器有800型中药粉碎机（青州市精诚医药装备制造有限公司）、

9、RE5299旋转蒸发仪、SHZIIIA循环水真空泵（上海一凯设备有限公司）、CJ一1680型超净工作台，YSQSG41280型手提式压力蒸汽灭菌锅、低温冰箱、指形管等。主要试剂有乙醇（上海凌峰化学试剂有限公司生产）、二甲基亚砜（DMSO）（国药集团化学试剂有限公司）、链霉素、青霉素；牛肉膏、蛋白胨、琼脂；蔗糖、Nacl、甲醇、HCl、NaOH等。以上药品均为AR级。1.2石榴叶提取物的制备采集石榴叶并经清洗和晾干；烘箱中65烘干后，用中药粉碎机粉碎1530s；称取100g粉末置入索氏提取装置的烧瓶中，加入75乙醇500ml，在电磁恒温搅拌器上搅拌煮沸回流萃取2h；真空抽滤后用旋转蒸发仪40浓缩

10、至干；称重后，用10 DMSO配制成配制成浓度为60mg/ml储存液备用。5。1.3石榴叶提取物对细菌的抑菌活性测定 将培养基制成平板，细菌用牛肉膏蛋白胨培养基。用无菌生理盐水把各种菌种（大肠杆菌和白色葡萄球菌菌种）配制成106107个L孢子悬液，吸取0.2 mL孢子悬液均匀涂抹到灭菌平板上。6用10% DMSO将石榴叶提取物配制成浓度分别为10 mg/L、 20 mg/L、 30 mg/L 、40 mg/L 、50 mg/L、 60 mg/L的溶液。将直径约0.4cm滤纸圆片置于各质量浓度的溶液中浸泡，将浸渍过提取物溶液的滤纸片风干，放到每个涂有菌液的平板上，等距离放4片，每个试验平行3次，

11、文中所列数据为平均值。细菌培养在37下24 h。测定抑菌圈直径大小，并用无菌水作空白对照(以CK表示)，以直径大于1.00cm为有效果来确定抑菌效果7。以上操作均在无菌条件下进行。统计结果（如图1）。图1 提取物的抑菌效果用10% DMSO分别配制链霉素、青霉素各浓度。链霉素：30u/mL、50u/mL、80u/mL、100u/mL、150u/mL、200u/mL；青霉素：10 mg/L、1 mg/L、10-1 mg/L、10-2 mg/L、10-3 mg/L。作为参照，将直径约0.4cm滤纸圆片置于各质量浓度的溶液中浸泡，将浸渍过提取物溶液的滤纸片风干，放到每个涂有菌液的平板上，等距离放4片

12、，每个试验平行3次，文中所列数据为平均值。细菌培养在37下24 h。测定抑菌圈直径大小，并用无菌水作空白对照(以CK表示)，以直径大于1.00cm为有效果来确定抑菌效果。以上操作均在无菌条件下进行7。统计结果。（见图2和图、3）图2 链霉素的抑菌效果图3 青霉素的抑菌效果1.4 石榴叶提取物对果蝇的毒理活性测定研究石榴叶提取物对果蝇的影响方案常采用棉球饲喂法。8。（1）配制果蝇培养基，饲养繁殖黑腹果蝇。（2）供试饲养液的制备：用2%的蔗糖水溶液作为对照培养液；在2%的蔗糖水溶液中加入不同量的石榴叶提取物，配制成一定浓度梯度：1、2、3、4、5及10mg/mL。（3）果蝇毒性试验：供试果蝇为黑腹

13、果蝇成虫，用乙醚麻醉后，饥饿56h后饲以不同浓度的供试溶液，准备10个指形管，每指形管中放置一个0.2g的脱脂棉球，棉球上蘸有大约2.5mL饲养液，各指形管中接入大约25头果蝇，设置5次重复，用2%的蔗糖水溶液作为对照组，所有的指形管置于温度25、相对湿度为5060%、光照周期为12D/12L的培养箱中，连续饲养4d，每1213h记录各处理的死亡果蝇数，4d统计汇总各组果蝇死亡数。9 。（见图4）图4 不同浓度下的死亡率图1.5 石榴叶提取物对槐蚜的杀虫活性测定石榴叶提取物的杀蚜活性测定采用室内叶片法。采集虫口密度大的国槐枝叶带回实验室，选择带蚜叶片，剔除不合格的虫，以大小适中的健康无翅成蚜为

14、试虫，并将带虫叶片修剪为每片25头虫左右，置于铺有滤纸的培养皿中。用10DMSO水溶液梯度稀释石榴叶提取物储存液，并喷洒于各个试验皿中，以10 DMSO水溶液作为对照，然后置于温度为25、湿度为80的培养箱内培养，24后统计蚜虫死亡率。每浓度3次重复，死亡率以3次重复的平均值计。10死亡率（%） 100 ； 校正死亡率（%） 100 。2 结果分析与小结2.1 石榴叶提取物及青霉素、链霉素对细菌的抑菌活性测定通过以上3个图表（图1、2和3）可以看出，提取物的成分与青霉素的效果相似，对白色葡萄球菌（即革兰氏阳性菌）有明显效果，而对大肠杆菌（即革兰氏阴性菌）无明显效果。2.2 石榴叶提取物对果蝇的

15、毒理活性测定结果由图4可以看出，提取物对果蝇有很好的触杀作用，浓度越高，死亡数越多。其触杀作用的毒力回归方程0.95515+10.07，相关系数为R20.9635，其LC50=52.36mg/ml表 石榴叶提取物对槐蚜的触杀作用（SEM，n=4）11提取液浓度mgmL-124h死亡率%24h校正死亡率%6096.841.296.725095.071.994.894086.31.289.522077.41.480.291038.92.140.35对照3.61.7注：表示与对照组比较差异显著（0.05）2 结果分析与小结2.1 石榴叶提取物及青霉素、链霉素对细菌的抑菌活性测定通过以上3个图表（图1

16、、2和3）可以看出，提取物的成分与青霉素的效果相似，对白色葡萄球菌（即革兰氏阳性菌）有明显效果，而对大肠杆菌（即革兰氏阴性菌）无明显效果。2.2 石榴叶提取物对果蝇的毒理活性测定结果由图4可以看出，提取物对果蝇有很好的触杀作用，浓度越高，死亡数越多。其触杀作用的毒力回归方程0.95515+10.07，相关系数为R20.9635，其LC50=52.36mg/ml2.3 石榴叶提取物对槐蚜的杀虫活性测定结果由表可以看出，提取物对槐蚜有很好的触杀作用，2040时，校正死亡率达到89.52；当浓度为60mgmL时，校正死亡率达到96.72。其触杀作用的毒力回归方程21.28120.71，相关系数为R2

17、0.864，LC50为10.4203mg/mL。2.4 绪论与讨论 小结石榴叶提取物对革兰氏阳性菌有明显的抑菌效果，对革兰氏阴性菌效果不明显；提取物对黑腹果蝇成虫有明显毒害作用，且毒性效果与浓度呈正相关，可用作除蝇成分。提取物对槐蚜有明显的防治效果，60mg/ml提取物24h后的防治效果达96.72，与目前使用的化学农药吡虫啉的防治效果相比无显著差异（P0.05）。石榴是我国重点发展的经济水果之一，在我国各地均有栽培，种植面积正大规模发展。但是在很多地区石榴叶仅作为茶叶饮用，这就造成了严重的资源浪费。在今后，社会应进一步加强石榴叶的药理活性成分研究，为临床研制出一个新的有效天然药物，为天然性新

18、药的开发打下良好基础12。石榴叶越来越明确的药理作用已经越来越受到人们的关注，相信随着对天然性药物研究的深入，必将拥有一个更加明亮的开发前景。参考文献1 周建华,胡建平.石榴生物活性物质的研究进展J.中国酿造，2008(14):4244.2 雷帆,邢东明,向兰，等.石榴叶提取物中鞣花酸在大鼠体内药物动力学研究J.药品评价,2005(1):2325.3 邓文龙,王浴生,等.中药药理与应用(二版) M.人民卫生出版社,北京,1998.4 赵彦君，师宝君，胡兆农杠柳毒素NW杀虫活性昆虫知识，2008，45(6)：9509525张羽飞, 于春丽, 张春枝.乙醇室温浸提法提取黄芩总黄酮的工艺条件J. 大连轻工业学院学报,2004,23(3):190193.6 周德庆. 微生物学实验手册M.上海科技出版社,上海，1987.7 付良臣,孟昭礼. 柳树中用抑菌活性物的初步研究J.当代生态农业, 2005, 21（1）：113 114.8 王菊凤, 李鹄鸣. 蛹