生物医学和环境科学卷期副本

1、生物医学和环境科学 2003年16卷03期 267275页怀牛膝多糖和枸杞多糖在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中非酶转化的抑制作用邓宏斌，崔大鹏，蒋建明，冯艳春，蔡年生，李殿东药用生物技术研究所，中国医学科学院和北京协和医学院 北京 10050，中国目的：探讨怀牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中非酶转化的抑制作用和机理。方法：血清年龄水平是由年龄-酶联免疫吸附，MTT法来确定，它们通常用于确定淋巴细胞增殖，IL-2活动由一种生物测定方法决定。自发活动被用于检测老鼠的神经肌肉活动，延迟的单步调试的方法被用来检查小鼠的学习和记忆能力，比色测定法被用来测定小鼠皮肤中羟脯

2、氨酸的浓度，邻苯三酚自氧化法用来确定红细胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果：在小鼠体内注入ABP或LBP后，我们发现小鼠体内血清年龄水平降低，羟脯氨酸在小鼠皮肤中的含量降低和自发运动活动在右旋半乳糖小鼠衰老模型被检测到，同时淋巴细胞增殖和IL-2活动、学习和记忆能力、红细胞的SOD活性都增强了。结论：ABP和LBP能抑制右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中小鼠体内非酶转化，ABP比LBP有更好的抑制作用。关键字：怀牛膝多糖（ABP）；枸杞多糖（LBP）；右旋乳糖；非酶转化；老化介绍我们之前的工作表明，给小鼠注射右旋半乳糖可以诱导类似加速老化的变化。老化模型显示，神经损伤会减少抗氧化酶活动，而产生

3、轻微的免疫反应，ABP是一种从中国草药牛膝的根中提取的活性成分。布鲁姆的研究表明，ABP能够加强免疫系统的免疫能力，抑制肿瘤细胞转移，增加白细胞的数量，从而保护了肝细胞。枸杞多糖（LBP）是一种从枸杞中提取的生物活性物质，它可以提升T，B，CTL，NK和M 细胞因子增强受肿瘤痛苦的小鼠和辐照受损小鼠的功能免疫，调节NIM网络，本研究的目的在于调查ABP和LBP在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中的效果，包括神经活动，血清年龄水平，皮肤羟脯氨酸浓度和自发运动活动，淋巴细胞核扩散和IL-2活动，学习和记忆能力，红细胞SOD活性。材料和方法受试物怀牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）由袁天根教授，上海有

4、机化学研究所，中国科学院提供。药物应该放在含有PBS和滤过0.22um膜的生理盐水。动物与治疗选用三个月大的雌性小鼠C57BL/6J（总共32只，18g22g重，由中国科学院实验动物中心提供，CAMS），并随机分为4组，每组8只小鼠。一周适应期后，小鼠们将会进行下列一系列的一个8周的日常治疗：1、给第一组的小鼠每只注射0.4ml PBS作为媒介物控制；2、给第二组小鼠每只按50mg/kg注射右旋半乳糖；3、给第三组小鼠每只按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg ABP；4、给第四组小鼠按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg LBP。8周以后，4组小鼠将会被杀死，并及时将它们的血清，

5、器官和组织收集起来，为后面实验做准备，将它们存储在-70温度下。年龄酶联免疫吸附测定年龄的定量测定将会由年龄酶联免疫吸附法来测定。简单地说，在96孔板上涂一层3ug/ml AGE-BSA，每孔100ul，放在4涂料缓冲液中过夜。孔板用150ul洗涤液（PBS，0.05二层20,1mmL/L NaN3）冲洗3次，然后再控板上注满1的正常山羊血清在100ulPBS在37下2小时。经过洗涤后，50ul的1:10稀释血清（样本）。添加稀释缓冲液（PBS，0.02二层20,1mmol/L，NaN3，1正常山羊血清)和50ml多克隆抗血清抗年龄在稀释缓冲液（1:3000）。孔板放在室温下孵化2小时，并在一

6、个水平旋转摇动床下温和搅拌。洗净后，补充100ml碱性磷酸盐共轭液和抗体稀释缓冲液（1:2000），把孔板放在37下孵化1小时。孔板要像上述那样子清洗6次，添加100ul的对硝基苯磷酸液到每一个孔板上。然后在3060分钟培养后，在光学密度（OD）405nm下同酶联免疫吸附试验（ELISA）显微镜下观察读数（3550，Bio-Rad）。AEG-BSA被用来作为一种竞争抗原来生成一个标准。样品的年龄值将由标准曲线来计算。淋巴细胞的增值诱导淋巴细胞增殖实验 淋巴细胞增殖将会进行一些描述性可接受的改变。动物死后在无菌条件摘除脾脏，细胞悬浮液的摩擦对无菌不锈钢组织钢丝网(100um)在10毫升磷酸盐缓冲

7、液中。污染细胞溶解的红细胞是治疗细胞球放在5毫升三羟甲基氨基甲烷-氨基盐氯溶解缓冲液（0.1 8摩尔/升 氯化铵在0.1 7摩尔/升 三羟甲基氨基甲烷 pH值7.2)在室温下放置2分钟。然后用磷酸缓冲液清洗，脾淋巴细胞是放在100 uL无血清细胞冻存培养基(RPMI) 1640介质中在10 6细胞/孔板 有或没有7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA）。孔板在37下孵化44小时后,，20 uL氯丁胶新型交联剂（MTT）(5毫克/毫升)添加到每个孔板和培养基中，在37培养6小时。读数在显微感光版阅读器(型号3550,生物阅读)在波长570 nm处。增殖的淋巴细胞被表示为刺激指数(外直径OD在57

8、0nm的测试样品/ OD的570nm非刺激控制淋巴细胞)。IL-2测定 IL-2活动决定使用生物测定,如前面描述的淋巴细胞是在5 x 106细胞培养/毫升24 h与7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA），将其无细胞上清培养液收集起来。重组人类IL-2标准和测试上层清液，用无血清细胞冻存培养液（RPMI）稀释1640介质在96孔微文化板块(1 00 uL /毫升)，和100 uL的细胞株-2（CTLL-2）细胞(写明ATCC)在4×105细胞/毫升RPMI 1640培养基中添加到每个孔板。这些细胞在解散深蓝色水晶中37下孵化6 h。OD在570nm是由一个显微感光版读者和IL-2活动

9、，根据标准曲线计算，数据被表示为U /毫升。自发运动活动测试 光电管笼的方法应用于测试自发的神经活动的老鼠,光电管装置(XZ-4模型，研究所纲目，中国医学科学院)由四个黑框(19×10厘米)。四光束与相应的光电管盒在外围的自发运动活动，老鼠被发现使用一个光电检测器在结束治疗老鼠被放置进一箱一箱/框。2分钟适应后，自发活动被记录了10分钟的活动，利用磷酸缓冲液治疗年轻老鼠被认为是一个标准的100%活动特聘数据分析。进一步通过测试获取内存 这个步骤通过方法被用来评估学习和记忆的能力，老鼠的试验装置(36 x 12×12厘米,MX-5模型，研究所纲目，中医学科学院)包括两个隔间:

10、一个黑盒,一盒光照亮高25厘米的顶部室。在两个框之间有一个直径3厘米的洞，在最后10天的处理，每个老鼠被放置在照明箱未用头撞击孔。当小鼠进入黑暗盒中，一个超足部电击(30 V,50赫兹)通过整个笼子网格。小鼠要逃离电击只有退到被照亮的“安全”侧。老鼠被每天训练了5分钟,进行1 0天记忆测试。在测试后，小鼠被放置到照明箱和延迟时间(以秒计算)和大量的错误记忆将会被记录5分钟。用磷酸缓冲液处理的小鼠将会被用作对比。羟脯氨酸测定 小鼠死后,皮肤样品从小鼠后背取。从每个小鼠身上取25mg(干重)的脱脂样本水解在2毫升 6mmol/L盐酸中，在140解析6 h。样本用氢氧化钠中和，然后溶解在15毫升蒸馏

11、水中。1毫升水解物的解决方案添加下列顺序:1毫升氯胺T(1.41%),1毫升3.156 mol / L,1毫升高氯酸试剂(20% p二甲氨基-对羟基苯甲醛)形成发色团为560 nm标准羟脯氨酸解决方案是用来生成一个标准曲线从15ug /毫升。超氧化物歧化酶(SOD)测定 SOD活性测定红细胞通过测量抑制邻苯三酚使用一个先前发表的自然氧化法与一些修改。焦棓酸解决方案(0.1mmol/ L)准备好了1毫米三盐酸,pH8.2。一个稳定的自氧化速率是达到和变化在325的OD 0.07 /分钟在房间温度的一个标准，曲线是由0.1 -0.5 ug /毫升SOD。样本OD随后被测量和活动是根据标准曲线计算。

12、数据分析 值被表示为x s。统计学意义上的差异实验组织是由学生的学习评价。结果血清年龄水平与右旋半乳糖小鼠显示水平增加血清年龄(6.38 + -1.55)而对照组小鼠(2.79 - 0.96)(P < 0.01),治疗组小鼠的血清年龄水平加上ABP与右旋半乳糖或LBP,分别为4.27 0.78和5.18 1.14(P < 0.01),分别表明ABP和LBP能防止年龄增加治疗的小鼠右旋半乳糖(图1). 图1 血清年龄水平的年轻和治疗小鼠血清年龄水平所决定的一个数据定量年龄酶联免疫吸附测定被表示为相对年龄单位/毫升(x + j,n = 8)。p < 001vs年轻,p <

13、001。p < 0.05 VS右旋半乳糖。IL-2生物测定 与右旋半乳糖小鼠表现出明显降低淋巴细胞增殖(2.08 0.25)和IL一2生产(9.32 1.54)体外相比三月大的对照组(p < 0.0 1)真好与右旋半乳糖小鼠加上ABP或LBP有一个增加淋巴细胞增殖和IL一2生产(p < 0.01),表明下降的免疫反应治疗的小鼠了右旋半乳糖ABP或LBP和ABP有一个更好的抑制效果比LBP(图2)。 图2 淋巴细胞增殖和IL一2生产的年轻和治疗的小鼠(A)伴刀豆球蛋白-引诱的(7 ug /毫升)脾淋巴细胞增殖氯丁胶新型交联剂（MTT）法刺激指数计算,:在570的测试样品OD /

14、 OD在570的非刺激控制。(B)IL一2活动(U /毫升)在伴刀豆球蛋白-治疗的脾脏的淋巴细胞是由一个生物测定数据被表示为x + s。n = 8,cP < 0.01 vs年轻,P < 0 01 cp < 0.05 vs右旋半乳糖。自发运动活动运动是由自发运动活动右旋半乳糖。治疗显著降低小鼠自发运动活动的年轻人(155 + 45)与对照组比较(282 + 66)(p < 0.0 1),是预防用真菌性右旋半乳糖，额外的治疗ABP或LBP(p < 0.05)(图3),抑制性能的ABP比LBP的高17.5%。图3 年轻小鼠的自发运动活动和治疗老鼠。小鼠从不同组中集中起来

15、，放置在光电管笼子和自发运动活动，记录电子日期被表示为平均每10分钟活动(x +年代,n = 8)计算:每组的活动/活动群bp < 0.01VS年轻，aP< 0.05 VS右旋半乳糖。小鼠的学习和记忆能力学习和记忆能力进行了延迟的单步调试方法。右旋半乳糖小鼠体内显示减少延迟的步骤通过(130 - 36)(P < 0.0 1)和更多的错误试验(0.74 + 0.47)比试验缩短延迟时间和增加内存错误在右旋半乳糖小鼠预防治疗ABP或LBP治疗(P < 0.0 1)(图4)。延迟时间的抑制作用ABP是28.7%高于LBP但错误的ABP和LBP治疗组两个低于右旋半乳糖组。羟脯氨

16、酸浓度的皮肤和红细胞SOD活性用右旋半乳糖治疗的年轻小鼠会导致增加皮肤羟脯氨酸内容(63.44 + 8.00)和红细胞SOD活性下降(3.7±1.8)(P < 0.01),而皮肤羟脯氨酸含量和红细胞SOD活性下降后上升另外治疗ABP或LBP,就是说,是预防的效果。右旋半乳糖从ABP 或LBP中提取(图5)。讨论 非酶转化广泛被认同作为现代医学的一种机制关于糖尿病和糖尿病并发症。先前的研究也从我们的实验室证明先进的糖化机理可以解释右旋半乳糖衰老模型，已成为一个热点搜索抑制剂的非酶转化在最近几年传统中药具有二千年历史的一直被证明是非常有效的养护,这启发人和糖尿病,许多研究人员在中国

17、已经开始研究抑制作用的中药在非酶转化一些化合物,如槲皮素,水飞蓟素,一直全面研究和显示抑制效应在非酶转化体外和体在这项研究中,我们的结果表明,治疗组ABP或LBP显著降低血清年龄层次、内存延迟时间和错误率,和皮肤羟脯氨酸过敏的老鼠也有显著增加电动机的活动,淋巴细胞增殖,药物生产和超氧化物歧化酶(SOD)活性。所有这些结果表明ABP和LBP是新的中药可以防止非酶转化反应体内。无论是人类和动物，衰老有关的免疫功能下降。免疫功能的下降与年龄相关传染性疾病增加。恶性肿瘤、自身免疫性疾病有丝分裂原诱导淋巴细胞增殖和IL-2生产标记老化。这项调查的发现,动物治疗ABP或LBP显示增加了与淋巴细胞增殖和IL

18、一2生产支持这可以防止ABP和LBP的下降通过抑制免疫功能非酶转化。图4 延迟时间和记忆错误率的年轻的被治疗的小鼠体内。步骤通过方法被用来确定延迟时间(A)和记忆错误率(B).。每只小鼠是训练了5分钟先“记住”系统十天后,老鼠被放置在同一个笼子和延迟时间(秒)和错误的数量记录电子。n = 8，aP<0.01 vs年轻,bp < 0.05 vs右旋半乳糖。 图5 羟脯氨酸含量和SOD活性在年轻和小鼠体内。(A)在皮肤羟脯氨酸浓度的鼠标是由一个比色测定数据被表示为x±s(ug /毫克干组织)。(B)草皮活动在红细胞的测定和数据被表示为x±s(100 u/mL血液).

19、 = 8,bp < 0.01 VS年轻的p < 0.01 vs右旋半乳糖。 神经系统老化是一个复杂的过程之前的报告表明：在右旋半乳糖小白鼠那里都是增加的脂褐质,丙二醛、单胺氧化酶B,和超氧化物歧化酶在大脑、心脏和肝脏,并降低程度的过氧化物歧化酶(SOD)在血清这些更改可能会直接或间接地导致大脑衰老。我们的研究结果表明,可以防止ABP或LBP下降的神经系统函数通过抑制非酶转化。 自由基方面起着非常重要的关键作用。SOD是一个关键酶在身体的衰老过程中，除老化当身体老化时，身体的本能能力会清除自由基使其含量降低，同时SOD也减少。蛋白质会改性由于年龄可能产生大量的自由基，在氧化的超氧化物

20、歧化酶的活性会降低或失去的身体产生的超氧化物歧化酶。在我们研究中，在红细胞SOD活性活动降低右旋半乳糖可以被ABP或LBP抑制。结果表明ABP或LBP能够抑制降低SOD活性和提高能力消除自由基和防止非酶转化。 老化的胶原蛋白交联理论认为增加胶原蛋白的交叉-链接在老化可能导致减少敏感性对酶和减少胶原蛋白的溶解性，弹性，灵活性。皮肤中的羟脯氨酸含量间接标记为胶原蛋白含量。在这项研究中，增加皮肤中羟脯氨酸含量即右旋半乳糖诱导可以抑制ABP或LBP，结果表明ABP或LBP可以延迟胶原蛋白衰老通过抑制非酶转化。 从我们的研究结果我们得出结论，ABP比LBP有更好的效果在抑制非酶转化方面。那为什么会发生这

21、种情况呢？是不是有一个共同的机制传统的中药多糖在抑制非酶转化？这是一个等待进一步的研究问题。参考文献1. Song，X.Bao，M.M,Li,D.D,和Li,Y.M.(1999).在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模式中的先进糖化.机械老化发展.108期.241 - 253页.2.Li,Z.K.D.D.(1997),怀牛膝的免疫调节性能.药学学报.32期.881 - 887页.3.Wang,Y.Zhao,H.Sheng,X,Gambino,P,E,Costello,B,和Bojanowski，K.(2002)保护的性能枸杞多糖对时间和高热诱导损伤。民族药物学.82期.169一l75页.4Mitsuhas

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