环介导等温扩增技术

1、环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术2015307360 吴祖雄l定义：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65恒温扩增，15-60分钟左右即可实现1091010倍的核酸扩增。扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循环l针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc区以及5 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。lLAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有

2、内引物被使用。lFIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5端的Flc区域序列相同。lF3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。lBIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5端的Blc区域序列相同。lB3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。LAMP

3、反应引物与对应模板区域反应引物与对应模板区域l第1步：内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3末端开始启动DNA 合成，合成一条以FIP为起始的新的DNA单链，并与模板链结合形成新的双链DNA。而原DNA双链中与模板链互补的非模板链将被取代而游离于反应液中。l第2步：原合成的以FIP为起始的DNA单链被置换而脱离，成为单链DNA，其在5末端F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。l第3步：引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP 为起始的新链，并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引物B3与模板上B3

4、c杂交后，以其3末端为起点也开始合成新链，并使BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为两端的单链。l整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMPLAMP的的基础基础结构结构. .l反应结束后，对扩增产物常进行焦磷酸镁沉淀检测（浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测、实时检测。l浊度检测：在LAMP反应过程中，会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物。由于LAMP能产生大量的扩增产物，衍生物的产量也会大增，于是呈现出白色浑浊。因此，通过观察白色浑浊的有无，可验证是否有靶基因存在。l荧光检测：钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合后处于淬灭状态。扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄

5、绿素，使钙黄绿素的淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。反应后加荧光染料法的优点是灵敏度较高，在直接观察不能准确判断结果时，加入荧光染料可增加其可视性，提高判断的准确度lLAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。l操作简单：只需一个水浴锅l快速高效：不需要预先的双链DNA热变性避免了温度循环而造成 的时间损失l特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 l高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。l

6、缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。lLAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA 进行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏准确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临床药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、病毒的LAMP 检测法。l流行性乙型脑炎病毒的检测：杜鹃等建立了流行性乙型脑炎病毒一步法RT-LAMP 检测方法，对GenBank 中登录的25 株JEV基因序列进行分析，设计该基因保守区域的RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3B3，2条内引物FIPBIP和2条环引物FLPBLP。在LAMP反应体系中加入逆转录酶和RNA 模板，65水浴60 min，反应可一步完成。l犬细小病毒的检测：杨慧等建立了犬细小病毒LAMP 检测方法，选取犬细小病