冷冻干燥或交联制胰岛素-壳聚糖纳米颗粒的设计,表征和生物效率(译文)

1、冷冻干燥或交联制胰岛素-壳聚糖纳米颗粒的设计，表征和生物效率M. Diopa, N. Aubervalb, A. Viciglioa, A. Langloisa, W. Bietigera, C. Muraa, C. Peroneta, A. Bekelb, D. Julien Davidc, M. Zhaoc, M. Pingeta, N. Jeandidiera, C. Vauthierd,E. Marchionic, Y. Frereb, S. Sigrista,*摘要: 胰岛素口服给药是理想的给药方式，但是由于胃肠道的苛刻条件没有效果。使用封装在自组装颗粒中的胰岛素的保护是有希望的方法

2、。然而，这种颗粒在生物环境中的稳定性缺乏导致口服给药后封装的胰岛素的生物利用度低。这项研究的目的是评价冷冻干燥和交联两种稳定策略的单独或联合作用，对胰岛素负载的壳聚糖纳米粒的影响，并确定其体外和体内的生物有效性。通过胰岛素和壳聚糖之间的复合凝聚制备纳米粒，通过与三聚磷酸钠溶液（TPP）交联或冷冻-干燥或两种方法同时处理而稳定。体外纳米颗粒吸收的生物有效性通过流式细胞仪对上皮模型（Caco-2 / RevHT29MTX（粘液分泌细胞）评估。在体内，纳米颗粒通过导管注射在对胰岛素缺乏的大鼠的腹膜或十二指肠。与不影响纳米颗粒电荷但降低纳米颗粒尺寸（-25）的交联相比，冻干在尺寸和电荷上增加（+15

3、vs control 412±7nm; + 36±0.3mV）。当两种方法组合时，与标准水平相比，连续处理降低纳米颗粒大小并增加电荷。没有冷冻干燥的，其中60的纳米颗粒在2小时后被破坏，与没有冷冻干燥的相比，冷冻干燥是必需的，用以防止纳米颗粒在肠环境中的破坏。另外冷冻干燥结合交联处理时提高了纳米颗粒的生物效率，当存在粘液时细胞中的摄取增加。在体内两种处理的组合显示了其对胰岛素的保护，当施用纳米颗粒时具有降低血糖的作用。这项工作表明，冷冻干燥和交联处理的组合是必要的，以在体外和体内胰岛素的递送中稳定（冷冻干燥）和增加自组装纳米颗粒的生物效率（交联）。关键词：壳聚糖 胰岛素 纳

4、米颗粒 口服 复合凝聚1.介绍 皮下胰岛素注射广泛用于糖尿病治疗。然而，注射通常是痛苦的，导致患者依从性低（Al-Tabakha and Arida,2008）。通过最大限度地减少注射，可以增加患者依从性，从而提高治疗疗效。口服给药是递送药物方便舒适的方法，因为其消除了与注射相关的疼痛和创伤。 然而，由于胃肠道的恶劣条件，口服给药会使胰岛素在到达血流之前使蛋白质变性。例如，小于0.1的口服胰岛素可以完好的地到达血流（Foss and Peppas,2004）。此外，低pH和蛋白酶介导的水解限制了完整胰岛素的肠吸收（Aoki et al.,2005）和转运到体循环中。因此，为了开发有效的口服糖尿

5、病治疗剂，保护胰岛素抵抗胃肠环境是必要的。已经开发了改善胰岛素摄取的方法，包括吸收促进剂，化学修饰和纳米胶囊或纳米球中的包封。聚合物胶体系统在治疗性蛋白质的口服递送中表现出一定程度的成功。 正在进行许多研究以改善使用递送系统的生物活性大分子的口服生物利用度。由天然聚合物，例如壳聚糖配制的纳米颗粒（NPs）作为蛋白质的载体是有利益的（Sarmento et al.,2007）。壳聚糖对于纳米颗粒开发具有许多优点，包括生物相容性，生物降解性，低免疫原性和毒性（Agnihotri et al., 2004；Pandey et al., 2005）。壳聚糖的粘膜粘附性质与其高正电荷密度有关（Plapi

6、ed et al.,2010）。因此，壳聚糖是药物递送到粘膜组织的理想物质（Sayin et al., 2009）。壳聚糖主链上的许多游离胺基团产生有利的性质，允许在药物递送应用中广泛使用。在酸性环境中，纳米颗粒自发形成，由于带正电荷和带负电荷的物质之间的分子内和分子间连接（Veis,2011），其形成聚电解质复合物（复合凝聚）。这个过程基于自组装的壳聚糖和胰岛素纳米颗粒，似乎有希望在不使用苛刻的有机化学品的情况下制备纳米颗粒。通过离子对和静电相互作用形成的纳米颗粒保留聚合物完整性。包括胰岛素在内的蛋白质的胃肠摄取可以通过包裹在纳米颗粒中来改善，纳米颗粒保护胰岛素免于降解。这些载体具有改善的口

7、服肽递送，这是由于它们在胃肠道中的长期保留和由游离氨基介导的对粘液层的良好渗透（Renukuntla et al.,2013）。正电荷可以与许多带负电荷的表面反应，包括细胞膜，粘液衬里中的唾液酸和阴离子聚合物。这些颗粒系统还对带负电荷的大分子（Mohammadpourdounighi et al.,2010）显示高亲和力，例如粘膜表面上的粘蛋白。此外，它们被肠细胞吸收，肠吸收是主要的吸收途径。然而，壳聚糖是非肠溶聚合物。因此，壳聚糖纳米颗粒不能在胃环境中保护胰岛素。在专利CA2522868（Belcourt et al.,2004）中提出了一种解决方案，其描述了基于含有保护肠中活性成分的纳米颗

8、粒的胃阻力制剂的双重包封系统。在以前的研究中，我们开发了适合于大鼠十二指肠特异性药物递送的肠溶胶囊（Reix et al.,2012），其可以填充胰岛素-壳聚糖纳米颗粒。在本研究中，我们评估了壳聚糖纳米颗粒在肠道条件下保护胰岛素的能力（Chaudhury and Das,2010）。然而，众所周知，在含有磷酸盐的环境中，复合凝聚是不稳定的。因此，这些复合物用作药物载体稳定。与三聚磷酸钠（TPP）的交联和冷冻干燥可能是一个有利的解决方案。三聚磷酸钠是具有三个带负电荷的磷酸基团的多价阴离子。该性质使其能够交联壳聚糖（Rekha and Sharma,2009）。冷冻干燥是在长时间内保存不稳定分子的

9、公认方法，包括生物技术-药物，例如蛋白质和肽（Sameti et al.,2003）。纳米颗粒可以在三聚磷酸钠，壳聚糖和胰岛素的混合物中通过三聚磷酸钠磷酸酯和壳聚糖氨基之间的分子间和分子内连接自发形成（Wu et al., 2005）。本研究试图使用交联和冷冻干燥法制备稳定的胰岛素负载的壳聚糖纳米颗粒，并进行体外和体内生物效率的验证。2.材料和方法2.1.材料 超纯的壳聚糖氯化物（CS Protasan UP CL113,75-90脱乙酰化，分子量70-150kDa）购自Nova Matrix（FMC BioPolymer，德拉门，挪威）。商业人胰岛素溶液（Umuline1 100IU / m

10、L）由Eli Lilly Pharma（Indianapolis，IN，USA）大量提供。由Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）提供人重组胰岛素，异硫氰酸荧光素标记的胰岛素，三聚磷酸钠溶液，D-甘露醇，异丙醇，胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，链脲佐菌素，24孔板（CELLSTAR1 organic Greiner） MO，USA）。用于高效液相色谱（HPLC）的化学品是液相色谱级。乙腈来自VWR（Fontenay-sous-Bois，France），无水硫酸钠来自SDS（Peypin，France）。人腺癌细胞系Caco-2获自ATCC（美国典型培养物保藏中心，Manassas，

11、VA，USA），RevHT29MTX细胞系由Dr.ThéclaLesuffleur（INSERM U505，Villejuif，France）提供。从Invitrogen（Cergy Pontoise，France）购买改良伊格尔培养基（DMEM），抗生素和抗真菌剂，非必需氨基酸溶液，谷氨酰胺，磷酸盐缓冲液（PBS）和Hanks平衡盐缓冲溶液（HBSS）。碘化丙啶和膜联蛋白-V试剂盒购自Clinisciences（Nanterre，France）。2.2.纳米颗粒制备 将壳聚糖氯化物CL113溶解于重蒸水（1mg / mL w/v）中。 在微量磁力搅拌（300rpm）下，通过注射器向

12、壳聚糖溶液（500mL）中滴加等体积的胰岛素。 将混合物在室温下缓慢搅拌下维持30分钟以获得标准（STD）纳米颗粒。 交联，将粉末溶解在重蒸水中来制备三聚磷酸钠溶液溶液（27mM）。 三聚磷酸钠溶液溶液（50L）引入到络合介质中并搅拌30分钟（300rpm）以获得交联的纳米颗粒。 在存在或不存在用作冻干保护剂的甘露醇的情况下，对天然或交联的纳米颗粒进行过夜冷冻干燥。甘露醇直接溶在纳米颗粒制剂（5mg / mL）中，然后冷冻干燥。 冷冻干燥后，将纳米颗粒以目标浓度分散在重蒸水中用于进一步分析。2.3. 纳米颗粒表征 纳米颗粒的物理化学参数通过动态光散射使用Malvern NanoZS（Malve

13、rn，Instruments，Worcestershire，United Kingdom）在25下在重蒸水中稀释至1:500。通过从纳米颗粒光散射强度的累积函数计算直径来确定平均纳米颗粒尺寸。还确定了全局表面电荷（电位）和多分散指数（PDI）。通过透射电子显微镜（TEM; Hitachi High Technologies Corporation，Tokyo，Japan）检查形态。在离心纳米颗粒分散体后测定包封效率（20,000×g，41小时）并通过高效液相色谱法定量上清液中没有包封的药物。该系统由两个Prostar 210溶剂递送系统，Prostar 410自动进样器和Prosta

14、r 330光电二极管阵列（PDA）UV / vis检测器（Varian，Les Ulis，法国）和Symmetry C18（4.6mm×250mm，5m，300A）柱（Waters，Milford，MA，USA）。洗脱液A由pH2.3的0.2M Na2SO4水溶液组成，洗脱液B是洗脱液A和乙腈（55:45，v / v）的混合物。流动相由洗脱液A /洗脱液B（42:58，v / v）的混合物组成，流速为1mL / min。柱温度保持在40，检测波长为214nm。使用以下等式计算包载功效（EE）：EE（%）（胰岛素的封装量/胰岛素的理论总量）×1002.3.1. 渗透压计算 我

15、们使用以下Van't Hoff方程计算渗透压（mmHg）： =(M /用于粒度测量的稀释因子)×R×T其中M是溶解物质的浓度（单位mol / L）。R是理想气体常数（0.08206L atm mol -1 K -1）。T是在开尔文（293K）上表示的温度。物种浓度：壳聚糖3.3×10-9M.胰岛素3.01×10-4 M. 三聚磷酸钠溶液1.28x10-3M. D-甘露醇0.027 M.2.4. 透射电子显微镜 使用在真空下的电碳沉积物使云母片亲水化。将合成的纳米颗粒（2mL）置于切片上1分钟，并除去过量的悬浮液。铀1的尿酸乙酯（1）加入到切片中，

16、1分钟后取出。通过Tecnai G2 Sphera（FEI公司，Hillsboro，NC，USA）分析样品。2.5.药物释放 在37缓慢搅拌下，与磷酸盐缓冲液孵育预定时间：Tx = 0,0.25,0.5,1,2和4小时。在1280nm测量从纳米颗粒释放的胰岛素的量。结果表示为胰岛素浓度的增加百分比，如下：(胰岛素 T0/ 胰岛素 Tx)× 100。2.6.稳定性测试制备 胃液（35mM NaCl，80mM HCl，pH 1.2）和肠内培养基（50mM KH2 PO4，15mM NaOH，pH 6.8）。将纳米颗粒与培养基在室温下孵育预定量的时间：T0 = 0小时，Tx = 0.5,1

17、,1.5,2,4和7小时。在500nm（Abs）下测量样品的光密度。结果表示为光密度的降低百分比，如下：(Abs.Tx/Abs.T0)×1002.7. 纳米颗粒的生物验证2.7.1. 体外验证2.7.1.1.模型和细胞培养。 使用两种细胞培养模型：Caco-2细胞和与75Caco-2和25RevHT29MTX细胞的共培养物，以获得体外肠上皮模型，如Nollevaux et al. (2006)。 细胞培养如Reix et al. (2012)。 简言之，将细胞接种（73000个细胞/ cm2）于补充有20胎牛血清，1抗生素 - 抗真菌溶液和1非必需氨基酸（10mM储备溶液）的DMEM

18、中。 使细胞在含有5CO2的气氛中在37下生长21天以获得肠细胞表型，并从第30代至第60代使用。将体外使用的纳米颗粒冷冻干燥，并且结果表示为几何平均值乘以荧光细胞的百分比。2.7.1.2. 壳聚糖的吸收 为了研究细胞中纳米颗粒的摄取，如Reix等人所述进行流式细胞术 （2012）。 将细胞在24孔板中培养21天，并与不含磷酸盐缓冲液的改良伊格尔培养基中的异硫氰酸荧光素-胰岛素负载的纳米颗粒（10IU /孔）孵育4小时。 孵育后，用不含钙和镁的Hanks平衡盐缓冲溶液溶液洗涤细胞3次（10分钟），并通过胰蛋白酶消化，离心并在Hanks平衡盐缓冲溶液中的悬浮分离。 悬浮后加入2L碘化丙啶和2L膜

19、联蛋白V-APC用以评估细胞活力。 通过BD LSR II流式细胞仪（Becton Dickinson and Company，Piscataway，NJ，USA）一式三份分析样品，每孔记录50,000个事件。 结果表示为荧光强度的几何平均值乘以异硫氰酸荧光素标记阳性细胞的百分比。2.7.2.体内验证 所有动物实验根据欧洲健康指导委员会关于动物的护理和使用的实验程序（批准号：AL / 60/67/02/13）进行。将雄性Wistar大鼠（120-140g）置于具有调节温度（23±1）室的房间中的标准集体笼中。将大鼠保持在12小时光照/ 12小时黑暗循环中，并喂以颗粒形式的标准实验室啮

20、齿动物饮食（SAFE A04，Villemoisson-sur-Orge，France）。食物和水随意获得。通过腹膜内单次注射链脲霉素（75mg / kg）诱导糖尿病。 3天后形成糖尿病（血糖> 6g / L和C-肽<100pM）。糖尿病大鼠经历手术以植入腹膜内（IP）和十二指肠（ID）导管。导管的近端皮下穿透以在颈部后部离开，并缝合。手术后两天，通过十二指肠途径向动物施用10IU胰岛素，通过腹膜内途径施用2IU胰岛素。 纳米颗粒生物功能通过在腹膜内治疗的大鼠中每30分钟评价空腹血糖4小时，并且每小时治疗12小时治疗的十二指肠。2.8. 统计分析 使用Statistica版本10（

21、StatSoft，USA）和GraphPad Prism 4（USA）分析数据。 结果表示为平均值±标准误。 所有数据通过单因素方差分析Tukey HSD检验法，事后检验进行物理化学和体外分析。进行重复测量方差分析测试用于体内研究。 当p <0.05时，认为差异显着。3.结果3.1. 纳米颗粒表征 标准纳米颗粒为412±7nm，电位为+36±1mV（表1）。 没有甘露醇的冷冻干燥显着增加了纳米颗粒尺寸（490±26nm）和电位（+44±1mV）。用甘露醇冻干显着减小尺寸至368±5nm和电位至+42±2mV。交联的纳米

22、颗粒为346±7nm，电位为+36±0.8mV。 具有或不具有甘露醇的冷冻干燥和交联的组合保持了纳米颗粒大小（分别为313±2和326±19nm）和电位（分别为+42±1和+42±1mV）。 所有的纳米颗粒具有小于或等于0.4的多分散指数。透射电子显微镜图像显示平滑和球形的纳米颗粒，并且该形态在冷冻干燥后保留（图1）。 高效液相色谱法测量表明标准和交联的纳米颗粒的截留效率分别为61和69（图2）。表格1冷冻干燥和交联过程对负载胰岛素的壳聚糖颗粒的物理化学特性的影响。标准纳米颗粒交联的纳米颗粒冷冻干燥甘露醇冻干标准纳米颗粒交联纳米颗粒标

23、准纳米颗粒交联的纳米颗粒尺寸标准差(nm)412±7346±7a490±26313±3a,b368±3a,b326±19b,c多分散指数0.3±0.060.31±0.040.4±0.080.3±0.060.3±0.070.3±0.05电位标准差(mV)+36±1+36±1+44±1a+0.3±1c+42±2a+43±1c 动态光散射测量，数据以平均值±标准差表示。 应用单因素方差分析Tukey法比较所有组。

24、 a.p < 0.05 与标准纳米颗粒比较. b.p < 0.05与不含甘露醇的冷冻干燥的纳米颗粒比较。 c.p < 0.05 与冷冻干燥的具有甘露醇的纳米颗粒比较。图1.胰岛素负载壳聚糖的透射电子显微镜。冷冻干燥前（A）和冷冻干燥（B）后装载胰岛素的壳聚糖颗粒的结构。交联颗粒具有相同的方面（未示出）。图2.壳聚糖颗粒的包封效率。 包封的胰岛素的高效液相色谱法定量（欧洲药典方案），象形图（）代表标准纳米颗粒，（）是用于交联的纳米颗粒。通过平均值±标准差表示颗粒，进行t检验（n = 3批合成）*p <0.001。3.2. 纳米颗粒稳定性测试 当不同的纳米颗粒制剂

25、在水中孵育7小时时，没有观察到光密度的变化（图3）。纳米颗粒立即溶解在模拟胃介质中，不管配方法（图3，红色）。在模拟的肠介质（图3，绿色）中，标准纳米颗粒在1小时后迅速破坏，84在7小时溶解。相比之下，20的冷冻干燥的纳米颗粒，有或没有甘露醇，在30分钟内溶解。这些纳米颗粒稳定7小时。 图3.模拟胃和肠介质中壳聚糖颗粒制剂的稳定性试验。（对于文本中对颜色的引用的解释，读者参考本文的web版本。） 通过在模拟介质中随时间推移浊度的演变进行稳定性测量。去离子水中颗粒的稳定性表示为黑色，肠介质为绿色，胃介质为红色。模式（）是用于非冷冻干燥的标准或交联的纳米颗粒，（）用于冷冻干燥的纳米颗粒和（）用于用

26、甘露醇纳米颗粒冷冻干燥。结果以比率表示：通过测量的吸光度T0在Tx处测量的吸光度。数据以平均值±标准差表示，应用方差分析（重复测量）以比较所有组，与去离子水相比，*p <0.05和*p <0.01，相对于冷冻干燥的纳米颗粒肠介质，#p <0.05和# p <0.01。3.3. 药物释放 无冻干标准交联纳米颗粒在37下在磷酸盐缓冲液中孵育时立即倒转（图4）。当颗粒冷冻干燥时，在磷酸盐缓冲液中温育15分钟后释放50包封的胰岛素，4小时后释放70。施用甘露醇的冷冻干燥时减少爆发释放25并在4小时内保持稳定。图 4.从壳聚糖颗粒释放胰岛素。通过紫外吸光法测量评价了在磷

27、酸盐缓冲液中壳聚糖的药物释放。（）用于冷冻干燥的标准颗粒，（）用于冷冻干燥交联的颗粒，（）用于加入D-甘露醇冷冻干燥交联的标准颗粒，（）用于加入D-甘露醇冷冻干燥交联的颗粒，(; ) 分别为干燥纳米颗粒（标准和交联）。结果以百分比标准差表示，几何平均值乘以荧光细胞的百分比。3.4. 使用Caco-2细胞的体外验证和共培养 与阴性对照相比，异硫氰酸荧光素-胰岛素荧光在纳米颗粒孵育后在Caco-2细胞和共培养物中增加。 在Caco-2细胞中，标准和没有甘露醇的交联冷冻干燥的纳米颗粒都与细胞高度相关（图5）。甘露醇诱导荧光的显着降低。 在共培养（图6）中，与具有或不具有甘露醇的标准纳米颗粒相比，具有

28、或不具有甘露醇的冷冻干燥的交联的纳米颗粒是高度相关的。有趣的是，Caco-2细胞呈现比共培养物更高的荧光。这可以通过共培养物中粘液的存在来解释。图5.在Caco-2模型上负载胰岛素的壳聚糖颗粒。 通过流式细胞术进行相关荧光测量，每孔记录50,000个事件，并且数据由Geo平均值乘以每个孔n = 3的荧光细胞的百分比（每n次9次测量）表示。 模式（）代表的阴性对照，（）代表冷冻干燥的标准颗粒，（）代表冷冻干燥的交联颗粒，（）代表具有D-甘露醇的冻干标准颗粒，（）代表施用D-甘露醇的交联颗粒。 数据以平均值±标准误显示，应用单因素方差分析Tukey法比较所有组与阴性对照ap <0.

29、001，与冻干标准纳米颗粒bp <0.001，与冻干交联的纳米颗粒cp <0.001。图6.在共培养模型上负载胰岛素的壳聚糖颗粒。 通过流式细胞术进行相关荧光测量，每孔记录50,000个事件，并且数据由Geo平均值乘以每个孔n = 3的荧光细胞的百分比（每个n，9次测量）表示。 模式（）代表的阴性对照，（）代表冷冻干燥的标准颗粒，（）代表冷冻干燥的交联颗粒的，（）代表具有D-甘露醇的冻干标准颗粒的，() 代表施用D-甘露醇的交联颗粒。 数据以平均值±标准误显示，应用单因素方差分析Tukey法以比较所有组，与阴性对照ap <0.001，与冷冻干燥的标准纳米颗粒bp &

30、lt;0.05，与冻干交联的纳米颗粒cp <0.05。3.5. 纳米颗粒毒性 与对照细胞（37）相比，在标准纳米颗粒孵育后观察到细胞活力的显着降低（表2）。具有甘露醇的冷冻干燥的纳米颗粒降低细胞凋亡（23）。使用在存在或不存在甘露醇（分别为22和20）的情况下冷冻干燥的交联的纳米颗粒，也降低了凋亡。使用共培养模型，除了在甘露醇（17）存在下冷冻干燥的交联的纳米颗粒，没有观察到活力的降低。表2评价胰岛素负载的壳聚糖颗粒对体外模型的毒性。阴性对照冻干用甘露醇冻干标准纳米颗粒纳米颗粒交联标准纳米颗粒纳米颗粒交联Caco-210063737779共培养1001009510083在流式细胞术中通过

31、逆染色与纳米颗粒孵育细胞后评价细胞活力，每孔记录50,000个事件，并且数据以百分比n = 3（每个n，9次测量）表示。 数据以平均值表示，应用单因素方差分析Tukey法比较所有组。 与阴性对照相比，p <0.001，与冷冻干燥的标准纳米颗粒相比，bp <0.001，与阴性对照相比，cp <0.001。3.6. 纳米颗粒的腹膜内施用 与接受盐溶液的大鼠相比，纳米颗粒的腹膜内施用显著降低糖尿病大鼠中的血糖（图7A）。 包封的胰岛素的效果类似于游离胰岛素，并且发生在相同的时间范围内，在输注后30分钟检测到血糖降低。 （图 7B）使用曲线下面积（AUC）证实了这些结果，揭示了腹膜内

32、施用后，游离胰岛素和包封的胰岛素具有相同的效果。图7.腹膜内施用负载胰岛素的壳聚糖颗粒。给予单剂量的2UI游离胰岛素或颗粒，并在定义的点测量大鼠血糖。（A）是血糖进展的表示，（B）是曲线下面积的表示。模式(; )代表盐水溶液给药（n = 5），( ;) 代表游离胰岛素给药 (n = 5), (; )代表冷冻干燥标准颗粒（n = 7），（ ; ）代表冷冻干燥交联的颗粒（n = 7），( ; )代表有D-甘露醇的冷冻干燥标准颗粒（n = 8）和(; )代表有D-甘露醇冷冻干燥交联的颗粒（n = 7）。结果以平均值±标准误方差分析（单因素）（重复测量（A）表示。应用Tukey比较所有组，与

33、阴性对照p <0.001。 3.7. 纳米颗粒的十二指肠内给药 颗粒的十二指肠内给药诱导血糖显着降低，而盐溶液和游离胰岛素没有作用（图8A）。曲线下面积的分析显示，与游离胰岛素相比，仅冷冻干燥的标准纳米颗粒通过十二指肠内给药具有降血糖作用（图8B）。图8.胰岛素负载的壳聚糖颗粒的十二指肠内给药。施用单剂量的10UI游离胰岛素或颗粒，并在定义的点测量大鼠血糖。（A）是血糖进展的表示，（B）是曲线下面积的表示。模式(; )代表盐水溶液给药（n = 4）, ( ;) 代表游离胰岛素给药 (n = 3), (; )代表冷冻干燥标准颗粒（n = 6），（ ; ）代表冷冻干燥交联的颗粒（n = 6）

34、，( ; )代表有D-甘露醇的冷冻干燥标准颗粒（n = 5）和(; )代表有D-甘露醇的冷冻干燥交联颗粒（n = 6）。结果以平均值±标准误方差分析表示（重复测量（A）应用Tukey法以比较所有组，与游离胰岛素和标准纳米颗粒相比，ap <0.01，bp <0.01，与阴性对照相比，cp <0.05。4.讨论 自组装的纳米颗粒是有效的药物载体，但不能用于口服胰岛素递送。在本研究中，制备稳定的自组装的装载胰岛素的壳聚糖纳米颗粒，通过交联和冷冻干燥稳定，并表征。我们进一步证明了稳定的纳米颗粒在体外和体内的生物效应。冷冻干燥可以稳定固有的不稳定的胶体，但是诱导纳米颗粒聚集，

35、因此增加纳米颗粒尺寸，添加表面活性分子以减少表面能和效价仍然受欢迎。蔗糖已被用于在冷冻干燥期间抑制甲氧基聚（环氧乙烷）-聚（乳酸）纳米颗粒的聚集（Zambaux et al., 1999）。在这项研究中，甘露醇被用作冷冻保护剂。甘露醇在纳米颗粒周围形成包膜，由此保持形态并在冷冻干燥过程中抑制聚集。鉴于甘露醇在负荷方面是中性的，其存在不改变纳米颗粒的全局负荷，其保持高度阳性。甘露醇在冷冻干燥过程中可能会产生电荷，从而避免纳米颗粒聚集。甘露醇是水溶性的，并且可以在分散过程中溶解以显示纳米颗粒表面负荷。软化冷冻干燥过程的存在避免了颗粒不稳定并且减少了爆裂释放现象。三聚磷酸钠溶液用于通过增加静电相互作用质量来提高纳米颗粒稳定性。选择三聚磷酸钠溶液作为聚阴离子交联剂，因为它是无毒的并且在与壳聚糖接触时立即凝胶（De Moura e