腺苷对缺氧复氧心肌细胞的保护作用_图文

1、研究论文腺苷对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用王兴祥1,3,周利龙1,丁家望2,冯义柏1,程龙献11华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,武汉430022;2宜昌市中心人民医院,宜昌443000摘要:本研究旨在探讨腺苷(adenosine,ADO对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R心肌细胞的保护作用及其分子机制。将原代培养的新生大鼠心肌细胞分成H/R对照组和ADO(110mol/L保护组。用倒置相差显微镜观察心肌细胞的生长状态。检测两组培养基质乳酸脱氢酶(LDH活性和心肌细胞Ca2+和丙二醛(MDA浓度。用EL ISA法检测肿瘤坏死因子(TNF2的表达,并用凝胶电泳

2、迁移率改变法(EMSA测定核因子(NF2B结合活性。所得结果如下:(1心肌细胞H/R培养后皱缩、变圆,伪足减少,ADO组心肌细胞的形态变化小于对照组;(2 ADO减少缺氧和复氧期间心肌细胞LDH的漏出(both P<0101;(3ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞内的Ca2+浓度(both P<0101;(4ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞MDA浓度(both P<0101;(5ADO抑制缺氧和复氧期间TNF2的表达(both P<0101;(6ADO抑制缺氧和复氧期间心肌细胞NF2B结合活性(both P<0101。以上结果提示:(1外源性ADO可减轻心肌细胞的H

3、/R损伤;(2外源性ADO抑制H/R期间心肌细胞TNF2的表达;(3外源性ADO可能通过抑制心肌细胞NF2B结合活性下调TNF2的表达。关键词:腺苷;缺氧/复氧损伤;心肌细胞中图分类号:Q463;R540Adenosine protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation injuryWAN G Xing2Xiang1,3,ZHOU Li2Long1,DIN G Jia2Wang2,FEN G Y i2Bai1,CHEN G Long2Xian1 1Depart ment of Cardiology,U nion Hospital A f f

4、 iliated to Tongji Medical College,Huaz hong U niver2 sity ofScience and Technology,W uhan430022;2Yichang People Hospital,Yichang443000Abstract:The aim of this study was to investigate the protective effect of adenosine(ADOon car2 diomyocytes following hypoxia/reoxygenation(H/Rand its molecular mech

5、anism.Primary cultured cardiomyocytes of neonatal rats were divided into two groups,namely H/R(controland ADO(110mol/Lgroups.The morphologic changes in cardiomyocytes were observed under an inverted phase2 contrast microscope.The following parameters of the two groups were determined:lactate dehydro

6、ge2 nase(LDHactivity,intracellular calcium concentration and malondialdehyde(MDAcontent.Tumor necrotic factor(TN F2assay was performed using an EL ISA kit and N F2B in the nucleus was analyzed by electrophoretic mobility shift assay(EMSA.The results are as follows:(1after H/R injury,car2 diomyocytes

7、 contracted,tending to get round in shape and its pseudopods decreased,while marked mor2 phological changes were not observed in ADO group;(2LDH leakage maintained at a lower level in ADO group than that in the control group during H/R(both P<0101;(3ADO significantly reduced the concentration of

8、calcium in cells and prevented calcium overload during H/R(both P<0101;(4 ADO markedly reduced the content of MDA during H/R(both P<0101;(5ADO inhibited the pro2 duction of TN F2during H/R(both P<0101;and(6ADO down2regulated N F2B binding activity of cardiomyocytes during H/R(both P<0101

9、。The results suggest that(1exogenous ADO attenuatesReceived2002205207Accepted20022082263Corresponding author.Present address:Cardiovascular Disease Department,First Affiliated Hospital,Medical School of Zhejiang University, Hangzhou310003,China.Tel:+86257528061397;E2mail:wangxx19730312yahoo1com1cnH/

10、R injury of cultured cardiomyocytes;(2exogenous ADO inhibits the production of TN F2after H/R injury;(3exogenous ADO prevents the activation of N F2B,which may be the molecular mechanism of down2regulation of TN F2expression.K ey w ords:adenosine;hypoxia/reoxygenation injury;cardiomyocytes腺苷(adenosi

11、ne,ADO作为心肌细胞的能量代谢产物,在缺血预处理的心脏保护中具有重要作用。近来研究发现,ADO可下调人和大鼠缺血心肌组织肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor2,TN F2的表达,而TN F2是中性粒细胞介导缺血/再灌注损伤的主要细胞因子1。目前对ADO下调TN F2表达的分子机制尚不清楚。有作者报道,心肌组织缺血/再灌注时,核因子B(nuclear factorB, N F2B活性持续增高24,且最近有研究表明ADO可抑制离体心脏缺血/再灌注时的N F2B活性5。而后者参与了一系列炎症因子的表达调控,包括TN F2。本文通过观察外源性ADO对缺氧/复氧(hypoxia/

12、reoxygenation,H/R心肌细胞的形态结构、损伤指标、TN F2表达及N F2B活性的影响,进一步从细胞水平明确ADO的心脏保护作用及其机制,并初步探讨心肌细胞缺氧/复氧损伤时TN F2与N F2B活性的关系,为其临床应用提供理论依据。1材料和方法111主要试剂和仪器胎牛血清和DM EM合成培养基购自G ibco公司。胰蛋白酶(trypsin购自Difco公司。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH试剂盒购自上海申能生物技术有限公司。丙二醛(malondialdehyde,MDA和TN F2EL ISA试剂盒购自北京邦定泰克生物技术有限公司。N F2B寡核苷

13、酸序列、T4多核苷酸激酶、T4激酶缓冲液均购自Promega公司。232PA TP购自北京福瑞公司。ADO购自Sigma公司。其余试剂为国产分析纯级。二氧化碳培养箱购自德国Heraeus公司;倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。112新生大鼠心肌细胞的原代培养取新生14 d SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供的心室肌组织并剪碎,用011%胰蛋白酶分次消化,分离心肌细胞。用含10%胎牛血清、100U/ ml青霉素、100g/ml链霉素的DM EM培养基制备细胞悬液,以差速贴壁法纯化心肌细胞,使纯度达到90%以上。以115×106/ml接种于预先用50 mg/L多聚赖

14、氨酸涂布过的培养瓶中,瓶中置盖玻片供细胞贴附生长,在37、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵箱内进行培养。每2d更换一次培养基,取培养4d的单层细胞进行实验。113H/R损伤模型的建立将心肌细胞用缺氧缺糖培养基培养后,培养瓶内立即充入215%O2+ 9215%N2+5%CO2(1L/min持续90s,以驱除瓶内氧气,37密闭培养2h。将缺氧的心肌细胞换用饱含95%O2+5%CO2的含糖培养基,在正常培养条件下培养1h,建立缺氧/复氧损伤模型。114实验分组将培养的单层心肌细胞分为2组: (1对照组:按照上述方法,制备缺氧/复氧损伤模型;(2ADO处理组:在培养基中加入ADO(110mol/L后

15、,立即按对照组程序处理。各组均缺氧培养2h后再给氧1h。收集缺氧前、缺氧后2h、再给氧1h后的培养基和心肌细胞用于后续实验指标测定。各组均在上述心肌细胞培养条件下培养3批细胞并做6份重复测试。115心肌细胞的鉴定心肌细胞的鉴定采用免疫组织化学方法。116心肌细胞生长状态的检测心肌细胞复氧1 h后,利用倒置相差显微镜观察心肌细胞的形态学改变,用台盼蓝排斥试验检测心肌细胞的存活率。117LD H测定取心肌细胞培养介质,用自动生化分析仪检测LDH。用紫外吸收法测定培养介质的蛋白质含量,计算细胞外液LDH比活性。LDH比活性(U/mg=LDH活性(U/L/蛋白质含量(mg/L。118细胞内钙含量的测定

16、采用原子吸收分光光度法测定细胞内钙含量。119MDA测定收集心肌细胞并用超声粉碎后,离心取上清。按试剂盒配制溶液,以015nmol/L的四乙氧基丙烷为标准品,测定吸光度并进行计算。1110TNF2的测定按试剂盒要求,采用双抗体夹心EL ISA方法测定心肌细胞产生的肿瘤坏死因子。本法测定TN F2的最低检测限为8ng/L,以OD值对浓度作线性回归,回归方程为OD=01118C +21124(r=019998。1111NF2B结合活性的测定本实验采用电泳迁移率改变法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA测定核因子B结合活性。(1核蛋白的提取与浓度测定

17、:收集心肌细胞,将其在缓冲液中匀浆,2000×g离心10min,弃上清。将沉淀重悬于缓冲液并剧烈震荡后,4000×g 离心10min ,弃上清。再将沉淀悬于缓冲液吹打混匀,14000×g 离心30min ,取上清。用考马斯亮蓝方法测定蛋白质浓度,并置于液氮中保存。(2探针的标记与纯化:N F 2B 结合序列:52A GTTG A GGGG ACTTTCCC 2A GGC 23。在消毒的离心管中混合以下试剂:N F 2B 寡核苷酸序列、缓冲液、232P A TP 、去离子水和T4多核苷激酶,置于37保温10min 后,加入ED TA 终止反应。将反应后DNA 样品用

18、G 225凝胶过滤柱层析,以除去未结合的小分子232P A TP 。(3建立结合反应体系:在消毒离心管中混合缓冲液、核蛋白、标记的N F 2B 序列和去离子水。将结合反应产物加入上样缓冲液,上样至5%非变性聚丙烯酰胺凝胶,以恒电压150V 进行电泳分离。当指示剂溴酚蓝行至凝胶下缘时,终止电泳,移开玻璃块,用3M 的Whatman 滤纸揭胶,并且在胶上覆盖saran 塑料膜。将胶及X 光片置于暗盒内,-20曝光2428h ,进行放射自显影和定影,并用MPIAS 型多媒体图像分析系统进行密度扫描。1112统计分析实验数据以mean ±SD 表示,用SAS 软件包作成组t 检验处理,计算P

19、 值,并设类错误=0101。2结果211心肌细胞的生长状态正常培养心肌细胞(图1A 呈梭形或不规则三角形,核呈卵圆形并居中,搏动规则,频率为80120次/min ,细胞存活率9515±311%;缺氧复氧损伤组心肌细胞(图1B 皱缩变圆,伪足减少,大多搏动停止,细胞存活率降至6112±217%(P <0101;ADO 组心肌细胞(图1C 的形态变化明显小于缺氧复氧损伤组,生长较好,细胞存活率为8816±219%,明显高于对照组(P <0101 。图1.腺苷对培养心肌细胞形态结构的影响Fig 11.Protective effects of ADO on

20、cultured cardiomyocyte.A :Myocytes in normal condition.B :Myocytes injured by H/R.C :Myocytes (H/R pretreated with ADO.Scale bar ,30m.94王兴祥等:腺苷对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用212心肌细胞膜通透性心肌细胞膜通透性以LDH从心肌细胞的漏出来衡量。正常培养条件下,心肌细胞培养基中LDH 的水平较低,与ADO组比较无统计学差异(P> 0105。对照组缺氧2h时,LDH漏出显著增加(P<0101,但低于复氧1h时的水平(P<0101,提示复氧可

21、以进一步损伤心肌细胞膜。ADO处理组缺氧2h和复氧1h时LDH浓度均明显低于对照组同时间点的浓度(both P<0101,提示在缺氧和复氧的过程中,ADO均可保护心肌细胞膜(表1。213细胞内钙含量正常培养条件下,心肌细胞钙含量较低,对照组与ADO处理组比较无统计学差异(P>0105。对照组缺氧2h时,细胞内钙含量显著增加(P< 0101,但低于复氧1h时的水平(P<0101,提示复氧进一步增加胞内钙浓度。腺苷处理组缺氧2h 和复氧1h时细胞内钙含量明显低于对照组(both P<0101,提示在缺氧和复氧的过程中,腺苷均可限制心肌细胞的钙超载(表1。214心肌细胞

22、脂质过氧化反应MDA是细胞内脂质过氧化反应的终产物,本文以其高低反映心肌细胞脂质过氧化反应水平。正常培养条件下,心肌细胞MDA的水平较低,与ADO组比较无统计学差异(P>0105。对照组缺氧2h时,MDA漏出显著增加(P<0101,但低于复氧1h时的水平(P<0101,提示复氧进一步增强细胞脂质过氧化反应。ADO处理组缺氧2h和复氧1h时MDA浓度均明显低于对照组同时间点的浓度(both P<0101,提示在缺氧和复氧的过程中, ADO均可抑制心肌细胞的脂质过氧化反应(表1。表1.腺苷对缺氧/复氧心肌细胞LDH漏出、钙浓度、MDA含量、TNF2表达和NF2B结合活性的影

23、响Table11Effects of ADO on LDH leakage,calcium concentration,MDA content,TNF2production and NF2B binding activity of cultured cardiomyocytes injured by hypoxia/reoxygenationGroupLDH(U/mgCalcium(ng/mg proteinMDA(nmol/LTNF2(ng/LNF2BNormalControl33111±516666145±51880147±0106916±21130

24、17±613 ADO34176±513767133±71650145±0107914±2133116±517 HypoxiaControl146176±1718#123187±11143#0189±0111#2816±718#5718±818# ADO87145±8197387144±618830152±010431615±21933414±5183 Reoxygenation215ADO对缺氧/复氧心肌细胞TNF2表达的影响正常培养条

25、件下,心肌细胞培养基中TN F2的水平较低,与ADO组比较无统计学差异(P> 0105。对照组缺氧2h时,TN F2浓度显着增加(P<0101,但低于复氧1h时TN F2的水平(P< 0101,提示复氧可以进一步上调TN F2的表达。ADO处理组缺氧2h和复氧1h时TN F2浓度均明显低于对照组同时间点的浓度(both P<0101,提示在缺氧和复氧的过程中,ADO均可抑制TN F2的生成(表1。216ADO对缺氧/复氧心肌细胞NF2B结合活性的影响正常培养条件下心肌细胞N F2B DNA结合活性很低,与ADO组比较无统计学差异(P>0105。对照组缺氧2h时,N

26、 F2B活性显著增加(P< 0101,但低于复氧1h时的水平(P<0101,说明复氧进一步激活N F2B。ADO处理组缺氧2h和复氧1h时N F2B活性均明显低于对照组(both P< 0101,说明在缺氧和复氧的过程中,ADO均可阻止N F2B激活(表1和图2。3讨论311心肌细胞的缺氧/复氧模型细胞是生物体结构和功能的基本单位,各种生命活动均以细胞为基础而完成。细胞培养作为基础研究技术之一,以其简单、经济、可靠和便于控制等优点,已被广泛用于医学和生物学的各个领域。本05生理学报Acta Physiol.Si n.,February25,2003,55(1:4752图2.腺

27、苷抑制缺氧/复氧损伤心肌细胞的NF2B结合活性Fig12.ADO inhibits NF2B biding activity in cultured car2 diomyocytes injured by H/R.Lane normal:myocytes in nor2 mal condition;lane H/R:reoxygenatin myocytes in control group;lane ADO+H/R:reoxygenation myocytes in ADO group;lane H:hypoxia myocytes in control group;lane ADO +H:

28、hypoxia myocytes in ADO group.实验在大鼠心肌细胞原代培养的基础上,构建了心肌细胞缺氧/复氧损伤的模型。心肌细胞经2h缺氧,1h复氧后,搏动减弱甚至停止,膜通透性增加,胞内钙超载,脂质过氧化反应增强。心肌细胞这些结构和功能的改变与心脏缺血/再灌注损伤的结果基本相似,提示心肌细胞的缺氧/复氧损伤可较为真实地模拟了心脏缺血/再灌注损伤的病理生理过程。312ADO的心肌保护效应内源性ADO是一种调节心脏功能的主要活性物质,尤其当心肌组织能量供应障碍时。本文结果提示ADO可减轻心肌细胞的H/R损伤:(1ADO 组心肌细胞形态变化较小,生长良好;(2缺氧和复氧过程中,ADO均

29、可减少细胞内LDH的漏出;(3 ADO降低心肌细胞钙含量,抑制胞内钙超载;(4 ADO减弱心肌细胞缺氧和复氧期间的脂质过氧化反应。通过观察外源性ADO对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响,从细胞水平直观地认识了ADO对心肌细胞的保护作用,为临床应用外源性ADO作为缺血心脏的保护剂提供了理论依据。313ADO下调TNF2表达TN F2是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,参与了多种心血管疾病的发生、发展,尤其在心肌缺血/再灌注损伤中具有重要作用。除胞内钙超载和氧化应激外,中性粒细胞是再灌注损伤的主要效应细胞,可与血管内皮细胞粘附并释放颗粒状弹性硬蛋白酶和活性氧,引起内皮细胞及其间质的损害。TN F2作用

30、于心肌细胞和内皮细胞,诱导产生细胞间粘附分子,促使中性粒细胞粘附而介导缺血/再灌注损伤6。本实验结果提示:正常培养条件下,心肌细胞培养基中TN F2水平较低,H/R刺激明显提高TN F2水平。近来研究发现,ADO可下调人和大鼠缺血心肌组织TN F2的表达,也可抑制脂多糖诱导心肌细胞或巨噬细胞TN F2的生成711。本文从培养心肌细胞的角度直接证实了外源性ADO可抑制H/R心肌细胞TN F2的表达。314ADO抑制缺氧/复氧心肌细胞的NF2B生理情况下,N F2B与其抑制蛋白IB结合在一起,以非活化形式存在。心肌缺血/再灌注时,胞浆IB浓度显著下降,N F2B活性持续增高24。激活的N F2B转

31、位至核内,与靶基因的B序列结合,增强后者转录,继而调节细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶和急性期蛋白等的表达,介导内皮细胞激活,诱导心肌细胞凋亡,加重了心肌组织的缺血/再灌注损伤。N F2B作为缺血/再灌注过程中多种内皮细胞激活分子的汇聚点,有可能成为防治缺血/再灌注损伤的理想靶点。本实验采用原代培养心肌细胞的缺氧/复氧模型,测定了心肌细胞N F2B的结合活性。结果提示,在正常培养条件下,心肌细胞培养基中N F2B的活性较低,而缺氧/复氧刺激可使其活性明显增高。外源性ADO显着抑制心肌细胞缺氧和复氧过程中N F2B的结合活性,这可能是其对心肌细胞缺氧/复

32、氧损伤保护效应的内在机制之一。ADO抑制N F2B 的结合活性可能与下例途径有关:(1ADO抑制缺氧/复氧心肌细胞氧自由基的产生;(2ADO直接抑制IB激酶的活性,提高胞浆IB水平。315NF2B与TNF2的关系心肌缺血/再灌注时氧化应激诱导活化的N F2B与IB解离后转位至细胞核内,与含有特定DNA 序列5GGGRNN YYCC3的TN F2基因的增强子和启动子结合,促进该基因转录并翻译。而抗氧化15王兴祥等:腺苷对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用 52 生理学报 A cta Physiol . S i n . , February 25 , 2003 , 55 (1 : 4752 剂 D TC

33、 可抑制心肌缺血/ 再灌注引起的 N F2 B 活 化 , 故认为氧化应激可能是 N F2 B 活化的关键因 素 。结合本文实验结果和以往文献 , 我们推测外源 性 ADO 对 TN F2 的影响可能通过减少氧自由基的 生成 , 继而抑制 N F2 B 的途径完成 12 。 值得一提的是 , TN F2 可磷酸化 氨基端调 IB 节区第 32 和 36 位丝氨酸残基 , 诱导 降解 , 从 IB 而激活 N F2 B 。在小鼠心脏再灌注早期 , TN F2 通 13 过激活 N F2 B 加重缺血/ 再灌注损伤 。也就是 说 , 在心肌缺血/ 再灌注过程中 TN F2 和 N F2 B 之 间

34、可能存在正反馈作用 , 这需要进一步实验证实 。 参 考 文 献 1 Winn R K , Ramamoort hy C , Vedder NB , Sharar SR , Harlan J M. Leukocyte2endot helial cell interactions in is2 chemia2reperfusion. Ann N Y Acad Sci 1997 ;832 :311 321. 2 Li C , Browder W , Kao RL . Early activation of tran2 scription factor N F2kappaB during ische

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