蛋白质工程试验项目

1、蛋白质工程试验工程实验一 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备实验二 豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳实验三 豌豆蛋白凝胶电泳后染色、脱色及观察 实验四 含目的蛋白 ERAF17 菌种活化及药品配制 实验五 BL21-ERAF17 目的蛋白基因的检测 实验六 目的蛋白 ERAF17 的诱导表达及蛋白处理 实验七 目的蛋白质电泳、染色、脱色及比照观察实验一聚丙烯酰胺凝胶电泳配制【实验目的】 通过本实验熟悉 聚丙烯酰胺凝胶的配置技术。【实验原理】：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在加速剂TEMED和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，可 以根据蛋白质带电荷、分子量大小等

2、将蛋白质别离，以此凝胶为支持物的电泳称 为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE【实验设备及药品1：垂直板凝胶电泳设备、移液器、烧杯、单体丙烯酰胺、交 联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺、加速剂 TEME和催化剂过硫酸铵。【实验步骤11 不同体积15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳别离胶溶液配制溶液成分总体积总体积总体积总体积总体积总体积5ml10ml15ml20ml25ml30ml15%水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5MTris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.

3、5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml2. 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间梳子的 齿长再加0.5cm。再在胶液面上小心注入一层无水乙醇异丙醇或水约23mm 高，以阻止氧气进入凝胶溶液。3别离胶聚合完全后约30分钟，倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。4制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备5%浓缩胶溶液4ml，一旦参加TEMED，马上开始

4、聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。不同体积5%聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶制备溶液成分总体积总体积总体积总体积总体积3ml4ml5ml6ml8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1M Tris(pH6.8)0.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10% SDS0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08ml10%过硫酸胺0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08mlTEMED0.003ml0.004ml0.005ml0.006ml0.008ml5.聚合的别离胶

5、上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心 防止混入气泡，再参加浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室 温下。实验二 豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳【实验目的】：学习植物可溶性总蛋白提取原理及方法，熟悉蛋白质电泳操作步骤，熟悉蛋白质别离的原理。【实验原理】：多数蛋白质都溶于水、盐溶液或有机溶液，别离纯化某一蛋白质 首先要求把蛋白质从组织或细胞以溶解的形态释放出来，并保持原来的天然状 态。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中由于 SDS带有大量的负电荷，由于不同的SDS- 蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于蛋白质分子量，因

6、此经过一段时间电泳后蛋白质混合物 会按其分子量大小别离。【实验设备及药品1：高速离心机、移液器、蛋白质电泳仪、微量移液器、恒温水浴锅、Tris-甘氨酸电极缓冲液、液氮、豌豆苗。NaCI8.0 g0.8 gKCl0.2 g0.02 gNaHPO1.44 g0.144 gKHPQ0.24 g0.024 gddHO定容1000 ml100 ml定容后调节pH值7.4。3 将PBS溶液置于4度预冷。4 将研钵，离心管，药匙用液氮预冷。5. 取各样品叶片分别约100 mg,注意取材后要立即称量。6. 将叶片放入研钵，参加液氮进行充分研磨。7. 将研磨所得的粉末转移到 Eppendof管中，参加冰冷的PB

7、S溶液200卩I,颠 倒混匀，立即置于冰上静止3-4小时使其充分溶解。8.12000转/分在4C条件下离心5分钟。9. 取上清液备用。10. 在蛋白质样品中参加1x的上样缓冲液，在100C加热8-10分钟使蛋白质预 变性。11. 待浓缩胶聚合完全后 30 分钟，小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上， 上下槽各参加Tris-甘氨酸电极缓冲液，必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的 气泡。12. 按顺序加样，加样量通常为30卩l 1.5mm厚的胶。13. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为 8V/cm。当染料前沿进入别离胶 后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达别离胶底部上方约 1c

8、m， 然后关闭电源。14. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔第一槽 凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。实验三 豌豆蛋白凝胶电泳后染色、脱色及观察【实验目的 】：了解蛋白染色脱色原理。【实验原理 】：考马斯亮蓝 R-250 即三苯基甲烷每个分子含有两个 SO3H 基团， 偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上， 考马斯亮蓝染色具有很高的灵敏度， 在聚 丙烯酰胺凝胶中可以检测到 0.1 mg 的蛋白质形成的染色带。酸甲醇溶液使蛋 白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散。【实验设备及药品】：水平摇床、蛋白质染色液及脱色液。【实验步骤】：1. 蛋白质染色液配制0.

9、25g 考马斯亮蓝 R25050ml 甲醇75ml 冰醋酸 用蒸馏水定溶到 1000ml2 蛋白质脱色液配制冰醋酸 75ml甲醇 50ml定容至 1L3. 电泳结束后，小心地将蛋白质凝胶剥离浸泡在染色液中，染色12小时或过夜。4. 染色结束后，取出凝胶浸泡在脱色液中，置于水平摇床上轻摇 23小时，必 要时更换脱色液，直至凝胶上的背景与蛋白质的比照度明显、 蛋白质带清晰可见， 背景显色很浅为止。5.脱色结束后，取下凝胶进行照相【实验目的 】：掌握菌种活化过程，熟悉无菌操作过程【实验原理 】：菌种活化就是逐级扩大培养，是为了得到纯而壮的培养物，即获 得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。 菌种发酵有

10、一般需要 2-3 代的复壮过程， 因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化 , 让菌种逐渐适应培 养环境。【实验设备及药品 】无菌操净台、高压灭菌锅、移液器、 LB 液体及固体培养基、 含有目的蛋白的菌种。【操作步骤 】：1. 实验准备阶段：玻璃平板、50ml、150ml或200ml三角瓶，黄色及蓝色枪头。2. LB 培 养基 的配制：液体： 1000ml胰蛋白胨 ( Tryptone ) 10g酵母提取物( yeast extract ) 5gNaCl5gPH=7固体培养基，上述物质溶解后参加琼脂粉 15g121 度高温灭菌 2 0分钟，待固体培养基不是特别热的时候参加卡那霉素，

11、使其终浓度为 50mg/l 。3. 取存于-70°C的菌种在固体LB培养基上划线，37°C温箱培养12-16 h。【实验目的 】熟悉原核表达载体中目的片段与表达蛋白所对应的关系， 对原核表 达载体目的基因进行鉴定。【实验原理】对原核表达载体中目的基因进行 PCR鉴定，通过PCR检测确定目 的蛋白基因的存在与片段大小。【实验仪器及药品】：PCR仪、电泳仪、移液器、Taq聚合酶、紫外凝胶成像系 统。【实验步骤 】：一、提取质粒1. 收集菌体2ml, 13000 rpm,离心2 min，弃上清液。2. 参加150卩l Sol I 含Tris, EDTA,葡萄糖重悬菌体，可用枪头剧

12、烈振荡。3. 参加 150 卩 l Sol II 0.2 MNaOH, 1%SDSi/v,需要现用现配，将 0.4 MNaOH 溶液和2%SD溶液等体积混合，小心轻混，缓慢上下颠倒 2-3次。此时溶 液呈黏稠状。4. 参加150卩l Sol川冰醋酸，醋酸钾小心轻混，缓慢上下颠倒2-3次。有白色絮转沉淀。5. 13000 rpm,离心3 mi n。，取上清液。参加等体积大约450卩l酚/氯仿/异戊醇使用时要注意用枪头吸下液面局部振荡混合。此时溶液呈乳浊状。6. 13000 rpm，离心3 min,取上清液。参加2倍体积无水乙醇约900卩l或1 ml，置于-20 °C醇沉 10min。7

13、.13000 rpm,离心 3 min，弃乙醇。参加 1 ml 70%乙醇，13000 rpm,离心 3 min， 弃掉溶液，自然枯燥15 min。注意保持质粒的湿润。8. 参加30 fl l火菌水溶解质粒后，于4°C保存。二、 1%琼脂糖凝胶电泳的制备1 选好胶板插好梳子。2称取0.25g琼脂糖 溶于25ml TAE缓冲液中。3 在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时参加1.5ul的EBr倒入胶板 中赶走气泡，使其凝固。4. 取2ul质粒参加2ul loadingbuffer混匀，上样、PCR及电泳体系组分总体系25ul用量卩l Premix rTaq酶12.5引物1 (10

14、卩M1引物2 (10卩M1DNA莫板3力卩ddH2O至U 25卩l1. PCR程序设定(1)94 t:预变性3分钟(2)94 r变性50秒(3)501退火50秒(4)721延伸50秒第二步到第四步30个循环(5)7218分钟(6)4t保存2. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1选好胶板插好梳子。2称取0.3 g琼脂糖 溶于30 ml TAE缓冲液中。的EBr倒入胶板3在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时参加1.5ul 中赶走气泡，使其凝固。4 在PCR产物中参加5ul loadingbuffer后混匀。5选择DNA2000 marker为标准上样。6PCR产物上样。7在紫外凝胶成像系统中观

15、察实验结果【实验目的 】：熟悉细菌液体培养过程，掌握诱导原核生物表达外源蛋白的原理 及方法【实验原理】目的基因ERAF17克隆在PET-28载体上，控制该基因的启动子为 诱导型启动子需要在培养基中参加乳糖类似物IPTG目的基因才会表达，参加IPTG 一定时间后目的蛋白在细胞中不断的积累，一定时间后表达量最大。【实验设备及药品】 ： 37度恒温摇床、移液器、恒温水浴锅、 IPTG。【实验步骤 】：1 挑取含有目的基因ERAF17的单菌落，接种于5 ml LB培养液中含50包/ml, 卡那霉素，37 C振荡培养过夜2取过夜培养液按 1:100 的比例扩大培养。3. 在OD600值时取1 ml菌液收

16、集菌体备用。取完菌液后，在培养液中加 入 IPTG 至终浓度 1.0 mmol/L 进行诱导，经不同的诱导时间 1 h， 2 h， 3 h， 后取 1 ml 培养物收集菌体。4. 将收集的所有菌体用1X蛋白上样缓冲液重悬，100 C 8-10min后离心，取上 清备用。实验七 目的蛋白质电泳、染色、脱色及比照观察【实验目的 】：进一步熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的配制方法及电泳过程，学习对 比观察电泳结果。【实验原理 】：目的基因在 IPTG 的诱导下表达，在不同时期收集大肠杆菌表达 的蛋白质， 通过电泳后会看到目的蛋白， 没有经过诱导的大肠杆菌不表达该蛋白 因此经过电泳后没有目的带。【实验设备及药

17、品 】：蛋白质垂直电泳仪、移液器、蛋白染色及脱色液。【实验步骤 】：1聚丙烯酰胺凝胶电泳配制方法见实验二 详细步骤 2取原核生物大肠杆菌诱导前、后各阶段的蛋白质进行电泳。泳道1低分子量蛋白Marker,按收集先后顺序进行电泳。3电泳后进行染色过夜 。4脱色及脱色。5比照观察。6. 拍照保存实验结果。蛋白质工程备选实验综合性实验 目的蛋白原核表达载体的构建实验一、目的蛋白基因片段的克隆 6 学时【实验目的】学习植物RNA勺提取，通过反转录PCF从植物基因组中克隆目的蛋 白基因。【实验原理】根据中心法那么，信使RNA羽译成蛋白质或多肽片段，欲获得在原核 生物中可表达的蛋白质需首先获得该蛋白质的基因

18、片段，使用植物mRNA提取试剂盒提取总mRNA通过反转录PCF可获得cDNA针对目的基因设计引物克隆目的 基因。【实验仪器及药品 】：低温高速离心机、制冰机、移液器、 1.5ml 离心管、植物RNA 提取试剂盒。【实验步骤 】：一、植物 RNA 提取1. 在液氮中研磨 100mg 植物叶片，将粉末参加到 1.0ml 的 Trizol 。2. 用1ml针筒，26 G号6 #针头抽吸匀浆液以剪切基因组 DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌 1.5ml 离心管中。3. 参加200山氯仿/异戊醇24 : 1 或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。4. 台式离心机上， 12000rpm ，室温离心 5 分钟。

19、5. 将上清液小心转移到 Rnase-free 1.5ml 离心管中，参加等体积的异丙醇， 室温下放置 5 分钟。6. 台式离心机上， 12000rpm ，室温离心 2 分钟。7. 尽可能彻底地吸走上清，防止 RNA 沉淀丧失。8. 真空离心枯燥 3-5 分钟，或放在室温下使酒精完全挥发。9. 沉淀用30-50JDEPC- H2O溶解。如发现沉淀难溶，68C处理10分钟。对于胰 腺，肾等组织中Rnase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。二、反转录 PCR1. 用不含 RNA 酶的 DNA 酶处理制备的 RNA 以除去可能含有的 DNA 杂质。2. 根据 RT PCR 试剂盒所提供的操作

20、手册进行反转录及 PCR 反响。20讪反转录体系如下:体积单MgCl10xdNTPIn hi-反转引物模板 H2O位M2bufferbitor录酶RNA检测样42210.5127品注：1. 本反响体系中的引物为 Oligo(dT) 15 Primer 。2. 转录条件：42 C 1小时；95 C 5分钟；4 C 5分钟。3. PCR反响：将管中的RT反响液稀释至100讪，取10山为模板进行PCR 扩增。三、通过特定引物克隆目的基因片段反响体系为：25ul体系体系组分用量(卩l )Premix rTaq酶12.5引物1 (10卩M1引物2 (10卩M1DNA莫板3加ddHO至U 25卩l实验二、

21、目的基因片段回收并与载体连接( 6 学时)【实验目的 】：将目的基因片段与原核表达载体连接。【实验原理 】：目的片段与目的载体同时使用相同的酶进行酶切处理，将两者按 一定比例混合后可连接为新的重组子。【实验仪器及药品】：37度恒温培养箱、制冰机、移液器、连接酶、DNA片段回收试剂盒。【实验步骤 】：1. 目的片段PCR产物电泳2. 电泳产物回收1) .切去含DNA片段的琼脂糖(100-300mg),尽量切得小一点，用吸头捣碎按质 量比1:3(切取重量：溶液A的体积比)参加溶液Ao2) .55-65 度水浴 10min, 直至胶完全溶化，期间可振荡助溶 2-3 次，待溶化后 置室温参加50ul溶

22、液B,充分混匀。3) .将溶液置于离心柱中，静置2min, >8000转离心30秒，假设一次加不完，可 分两次离心。(静置2min,是必须的，否那么明显影响回收效率).4) .倒掉液体，参加500ul溶液C于离心柱中8000转离心30秒，弃溶液。5) . 重复步骤 4o6) .12000转再次离心1min,甩干剩余液体以除去剩余酒精.7) . 将离心柱置于新的离心管中，温室敞开离心管盖放置5-10min ，使乙醇挥发 殆尽。8) .参加20-30ul溶液D (50度水浴)，静置2分钟。9) .12000转离心2分钟，管底溶液即为所需 DNA将DNA储存于-20度可长期 保存。3. 目的片段与载体双酶切4. 酶切产物回收后连接反响体系如下 20ul目的片段10ul载体片段3ul连接酶1ul连接 buffer 水 4ul2ul实验三连接产物转化及鉴定6学时【实验目的】：通过本实验学习重组子扩增的原理及鉴定。【实验原理】：当细菌处于容易吸收外源 DNA勺状态时，为感受态，低温时质粒 容易与感受态细胞吸附，经升温热刺激后被感受态细胞吸收， 质