驴用乳酸菌制剂生产技术规程

1驴用乳酸菌制剂生产技术规程本文件规定了乳酸菌相关的定义和术语、生产技术流程、发酵环境和设备要求、产品质量检测和保藏运输。本文件适用于驴用乳酸菌制剂的制备生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB20287农用微生物菌剂GB3095环境空气质量标准GB/T19525.2畜禽场环境质量评价准则GB5749生活饮用水卫生标准GB13078饲料卫生标准NY/T5027无公害食品畜禽饮用水水质3定义和术语下列定义和术语适用于本标准。3.1乳酸菌（lacticacidbacteria，LAB）能够利用且可发酵碳水化合物并产生大量乳酸的一类能被革兰氏染色成紫色（阳性）的细菌的统称，在毛驴养殖中可作为饲料添加剂和养殖场除臭剂。注：本标准中涉及的乳酸菌主要包括马属动物源的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳杆菌(L屎肠球菌(Enterococcusfaecium)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。3.2甘油菌theGlycerinstrain由马属动物（马和驴）肠道内容物分离纯化并鉴定的单菌落，添加15%~20%的甘油，在-80℃保存的菌种。23.3一代菌种first-generationofstrain甘油菌接种至液体培养基玻璃三角瓶中活化，37℃12h培养的菌种。3.4二代菌种Second-generationofstrain玻璃三角瓶中的一代菌种接种至发酵罐中，在发酵罐中37℃富集培养12h的菌种。4发酵设备和环境4.1发酵设备发酵设备为不锈钢全自动液体或固态发酵罐，根据生产规模选择发酵罐体积。4.2环境4.2.1发酵生产车间空气质量要符合GB3095中Ⅱ类标准要求。4.2.2发酵用水应符合GB3838-2002标准中Ⅲ类地表水质要求，其他用水应符合该标准中Ⅳ类水质要4.2.3发酵车间要完善消毒灭菌设备，各个操作间或发酵车间应独立且联通部都设有除菌设施。4.3消毒实现每日或定时消毒。工作人员下班后，进行彻底消毒。5发酵工艺流程5.1发酵工艺流程见附录A。5.2培养基5.2.1复苏培养基应保证甘油菌和一代菌种能够快速复苏、促进生长、营养丰富。5.2.2生长培养基应保证二代菌种大量富集生长的条件下，应与发酵培养基相近。5.2.3发酵培养基应保证促进生长、来源广泛、价格低廉、制备简便等特征。5.3菌种物种及纯度鉴定5.3.1用于发酵生产的菌株应通过了生理生化及分子鉴定，具有完善的菌株来源及安全性报告等相关信5.3.2在发酵前应采用稀释平板法检测一代和二代菌株的纯度及生长性能，如不合格，及时纯化复壮。35.3.3发酵生产前,需检测种子罐中菌体的浓度，浓度达到大于或等于108CFU/mL以上，pH值小于4.0。5.4灭菌5.4.1复苏培养基和生长培养基采用全自动高压锅灭菌，条件为121℃,30min，0.1MPa～0.15MPa，自然冷却后进行培养。5.4.2发酵罐的装液量小于总体积的2/3，干粉培养基溶解后导入发酵罐中。液体发酵前，将发酵罐设备采用高压蒸汽进行彻底灭菌，条件为120℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa，30min～40min,自然冷却后进行发酵。5.4.3固态发酵前，物料起始含水量控制在45%～55%，采用高压蒸汽进行彻底灭菌，条件为120℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa，1.0h～3.0h。5.5接种甘油菌到一代菌种接种量为0.1%～0.5%，二代种子到发酵罐接种量为10%～20%。所有步骤均在无菌环境下操作，厌氧或微好氧培养。5.6发酵5.6.1乳酸菌的培养温度应控制在32℃~37℃。5.6.2应在厌氧条件或微好氧条件发酵，液体可处于静置发酵，固态发酵搅拌转数100r/min～150r/min。5.6.3当有效活菌数大于或等于108CFU/mL以上，且pH小于4.0，结束发酵。5.6.4发酵生长周期为36h～48h。5.7保藏5.7.1液体培养物进行差速离心，浓缩菌液（105m3/h），按照1:1比例加入保护剂混合，采用大型冻干机冻干后，4℃保藏。活菌数检测见附录B。保护剂配方见附录C。冻干条件见附录D。5.7.2固态菌剂经干燥后无菌密封包装，4℃保藏。6产品质量检测相关产品质量检测包括水分、pH、有效活菌数和污染率等指标，检验合格才能出厂。所有指标均按照按GB20287执行。7储存及运输7.1贮存在通风、干燥、洁净的仓库。7.2运输时，防止极端环境影响，避免受压或损伤，运输工具保持清洁。（资料性）乳酸菌生产技术流程图5菌数检测B.1浓缩前活吸取1ml菌液，准确加入38℃~40℃无菌生理盐水9ml，振荡使其充分分散，倍比稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8，4个稀释度，每个稀释度设3个重复。取10-7，100ul涂板，培养，菌落计数。B.2冻干后菌数检测完全冻干后收集干粉称重，称取5g样品，准确加入38℃~40℃无菌生理盐水10mL，振荡使其充分分散，倍比稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8，4个稀释度，每个稀释度设3个重复。10-8取100ul涂板，培养，菌落计数。冻干剂配方表C.1冻干剂配方物料名称百分比脱脂乳5%（1mL纯化水放0.05g）蔗糖9%（1mL纯化水放0.09g）冻干条件表D.1冻干条件产品类别参数预冻时间（分）温度(℃)-36冷阱