携带反义c-myc的重组腺病毒安全性研究

1、    携带反义c-myc的重组腺病毒安全性研究        摘要】目的研究携带反义c-myc的重组腺病毒(Ad-ASmyc)潜在的副作用，评价其安全性，为其进一步进入临床试验提供依据。方法用Ad-ASmyc感染HeLa细胞，制备细胞提取液后反复两次感染HeLa细胞，观察Ad-ASmyc的繁殖、扩增，以及对HeLa细胞的作用，RT-PCR检测其DNA的转录；确定Ad-ASmyc对作为正常细胞的人胚肺二倍体细胞2BS的感染能力，绘制细胞生长曲线，观察Ad-ASmyc对正常细胞

2、的毒性；给Balb/c小鼠腹腔注射重组腺病毒后，每日观察一般状况，化验肝、肾功能，PCR检测Ad-ASmyc在重要脏器中的分布，显微镜观察重要脏器的病理学变化。结果Ad-ASmyc是一复制缺陷型腺病毒，它能高效感染2BS细胞，但并不影响其生长，小鼠体内应用后，无急性毒性症状发生，在肝、肾、胃、脾内可检测到腺病毒的分布。但在注射109 pfu第6天、第12天的小鼠肝组织内可观察到轻微炎症。结论Ad-ASmyc应用是安全的，可以进入临床试验。【主题词】重组腺病毒载体；反义c-myc；安全性；基因治疗 Safety evaluation of Ad-ASmyc in vitro and in viv

3、oZHANG Haizeng, LIN Chen, WEI Yue, et al.（ Department of Abdominal Surgery, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China）【Abstract】ObjectiveTo assess the safety of adenovirus-mediated transfer of anti-sense c-myc(Ad-ASmyc).MethodsRT-PCR was

4、 used to detect the transcription of Ad-ASmyc in HeLa cells infected with extracts from HeLa cells previously infected with Ad-ASmyc. Cell count was used to observe the effects of Ad-ASmyc on the growth of normal human fetal lung diploid cell line 2BS. Ad-ASmyc was given to 2 groups of Balb/c mice b

5、y intraperitoneal injection at a dosage of 107 pfu and 109 pfu respectively. Blood samples were obtained from the mice for liver and renal function tests. PCR was used to screen the vital organs for the presence of adenovirus DNA. Microscopic examination of the vital organs was performed to observe

6、the pathogenicity of Ad-ASmyc.ResultsAs a replication-defective virus, Ad-ASmyc could infect 2BS cells effectively, but did not inhibit 2BS cell growth. No mouse died and no signs of general toxicity following intraperitoneal injection of Ad-ASmyc were observed. In mice injected with 109 pfu Ad-ASmy

7、c, the adenoviral vector was found in the liver, spleen, kidney, and stomach. On day 6 and day 12 after injection, mild inflammatory infiltration of mononuclear cells was observed.ConclusionThe use of adenoviral vector for antisense c-myc gene transfer in vitro and in vivo is considered to be safe f

8、or clinical trial.【Subject words】Recombinant adenovirus vector;Antisense c-myc;Safety;Gene therapy腺病毒载体是目前基因治疗领域内最为广泛应用的病毒载体之一，且已成为体内基因治疗方案的首选载体。自从1993年美国国立卫生研究院批准第1例腺病毒(adv)介导的基因治疗临床方案，目前世界范围内的肿瘤基因治疗临床方案已有超过10项采用adv 作为载体1。目前应用的adv载体多为E1、E3区缺失的第1代adv载体，为复制缺陷adv，这已为很多实验所证实，但也有人发现，它可能经同源重组等原因而重新获得复制能力

9、。在动物体内接种远高于治疗剂量的重组adv时(>107 pfu) 并无明显的临床症状，但靶器官内可有剂量依赖性的轻微炎症。安全性是adv载体临床应用的关键问题之一。我室构建的携带反义c-myc重组腺病毒(Ad-ASmyc）已在多种肿瘤细胞体外、体内试验中证实具有明显的治疗效果。为评价其安全性，我们对Ad-ASmyc的复制能力及其对正常细胞、正常组织的作用进行了研究，为其进入临床试验提供依据。材料与方法1.细胞系：腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系293（购自加拿大Microbix Biosystems公司），人肝细胞癌细胞系BEL-7402，人胚肺二倍体细胞2BS和人宫颈癌细胞系HeLa均

10、为本室保存。2.Ad-ASmyc构建、扩增、纯化、滴度测定：采用同源重组法构建表达反义c-myc的重组体腺病毒Ad-ASmyc。用构建好的重组adv感染293细胞，48 h后，细胞出现完全病变时，收集细胞，离心，弃去上清，PBS重悬，冻融3次，再离心，取上清，加入10%甘油，0.25 m滤器过滤、分装后，于-70保存。用有限稀释法进行滴度测定。3.病毒感染率的测定：用带有LacZ报告基因的Ad-LacZ按不同的感染复数(multiplicity of infection， MOI）感染细胞，2448 h后固定细胞，X-Gal染液染色，显微镜下观察被染成蓝色的细胞即为LacZ基因表达的阳性细胞，

11、计数蓝染百分率，确定重组adv的感染效率。4.感染病毒扩增试验2：由于HeLa细胞对adv敏感，故我们采用HeLa细胞来进行此项实验。HeLa细胞接种3×106细胞100 mm平皿，培养过夜，按MOI=100感染Ad-ASmyc 和Ad-LacZ，分别感染两皿。感染第3天后，进行如下处理：观察形态。每组取一皿提取RNA待行RT-PCR。另一皿用于收集细胞，PBS重悬，-70及37水浴中35次充分冻融，离心去除细胞碎片，收集上清即为第1轮细胞提取液。用第1轮提取液感染HeLa细胞(5×105/100 mm平皿)。第5天后用上述方法分别提取RNA及制备第2轮细胞提取液。重复上述

12、步骤，提取第2轮提取液，感染第5天后HeLa细胞的RNA。5.细胞生长曲线：于35 mm培养皿接种一定量的细胞，培养过夜，按一定MOI感染细胞，观察形态。每种处理于每个时间点设3个平行组。定期消化收集细胞，2%台盼蓝染色，显微镜下分别计数活细胞和死细胞，求平均值及标准差，绘制生长曲线。6.RT-PCR：提取总RNA，定量后进行逆转录，逆转录产物行PCR，tubulin为内对照。c-myc引物(扩增产物250 bp)上游：5-CTCTCAACGACAGCAGCC-CG-3；下游：5-CCAGTCTCAGACCTAGTGGA-3；tubulin引物(扩增产物410 bp)上游：5-CTCATCA-

13、CAGGCAAGGAAGAT-3；下游：5-TTAAGGTAAGTG-TAGGTTGGG-3;adv引物(扩增产物860 bp)上游：5-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3；下游：5-CATCT-GAACTCAAAGCGTGG-3。退火温度5255，扩增c-myc的退火温度为52，33个循环；扩增adv的退火温度为54，40个循环。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，照相。7.小鼠体内实验2：Balb/c雄性小鼠6周龄（购自中国医学科学院肿瘤研究所动物室），按体重随机分为3组，每组分别经腹腔注射PBS(对照)、Ad-ASmyc (107 pfu只)及Ad-ASmyc(1

14、09 pfu只)。每日观察一般状况，包括日常行为、食欲、皮毛色泽、反应灵敏性、活动、腹泻、体重。每组分别于注射后第3，6，12天各处死1只小鼠，取血，行肝、肾功能检查。取心脏、肺、肝脏、脾、肾、胃、肌肉7种重要脏器，行病理组织学观察。取上述脏器，提取DNA，定量后取4 g用于PCR，来评价adv在机体内各器官的分布状态。adv引物同RT-PCR，复性温度为54，40个循环；PCR产物20 l行1.2琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察，照相。结果一、Ad-ASmyc的体外扩增实验为确定Ad-ASmyc是否有复制能力，我们采用HeLa细胞感染adv后制备细胞提取液，以连续感染的方法进行研究，若adv有复制

15、能力，则病毒在第2轮、第3轮感染后均可繁殖和扩增，经RT-PCR扩增出adv DNA的转录产物。结果表明，经Ad-ASmyc感染的HeLa细胞出现形态学变化，RT-PCR可扩出相应的adv条带，而用细胞提取液感染细胞时却没有出现相似的形态学变化，RT-PCR也未扩出相应的adv条带(1)。M：174；1：阴性对照；2：Ad-LacZ感染HeLa细胞后第3天；3：第1轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天；4：第2轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天；5：Ad-ASmyc感染HeLa细胞后第3天；6：第1轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天；7：第2轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天1Ad-AS

16、myc在HeLa细胞中的扩增实验 二、Ad-ASmyc对正常细胞的感染及毒性1.重组adv的转导效率：已知重组腺病毒能在癌细胞中高效介导基因转移，为了确定能否在正常细胞中有效转导，我们用不同MOI的Ad-LacZ感染2BS细胞及BEL-7402细胞，结果显示：MOI=100时，95%以上的2BS细胞即能被感染；MOI=200时，BEL-7402细胞90%以上可被感染；在以后的实验中，2BS、BEL-7402细胞的感染强度分别采用MOI=100和200。2.Ad-ASmyc感染2BS及BEL-7402细胞后的形态学观察：感染Ad-ASmyc后，2BS与对照组相比无明显变化，而BEL-7402细胞

17、则发生了明显的形态变化：细胞变圆、皱缩，甚至凋亡(2)。2 重组腺病毒Ad-ASmyc感染细胞后形态学表现。×100 2a:Ad-ASmyc感染2BS细胞;2c:BEL-7402细胞;2d:Ad-ASmyc感染BEL-7402细胞 3.感染Ad-ASmyc对2BS、BEL-7402生长的影响：2BS生长基本不受影响，而BEL-7402细胞生长则受明显抑制。Ad-ASmyc抑制2BS、BEL-7402细胞内c-myc的表达，表明Ad-ASmyc已经感染了这两种靶细胞，且目的基因已获得表达并行使了功能(3)。A：2BS细胞；B：BEL 7402细胞；M：174；C：对照；d2、d4、d6

18、：转染后第2，4，6天3Ad-ASmyc对转染细胞内c-myc表达的影响三、Ad-ASmyc小鼠毒性体内试验1.一般状况：腹腔注射PBS及Ad-ASmyc 后，各组小鼠在体重、食欲、活动度、灵敏度、皮毛色泽等方面均无明显差别，无腹泻，无任何全身毒性反应，无死亡。2.肝、肾功能化验：肝、肾功能化验分别取有代表性的谷丙转氨酶(SGPT)及血尿素氮(BUN)来比较，结果各组动物的SGPT及BUN均在正常范围。3.注射adv后各种重要生命脏器的病理学变化：注射adv后第3天，与对照组相比，各组中重要脏器病理学表现没有明显变化；注射109 pfu组在第6，12天，肝脏内可见轻微炎症表现，主要表现为汇管区

19、内单核细胞及淋巴细胞浸润，但肝脏的组织结构及细胞形态与对照组相比，并无明显差别。4.注射adv后第3天adv的分布：107 pfu组，PCR检测不到adv的存在。109pfu组，在肝、脾、肾、胃内可扩出相应的adv条带(4)。A：腹腔注射Ad-ASmyc 107 pfu；B：腹腔注射Ad-ASmyc 109 pfu；M：174；1：心；2：肺；3：肝；4：脾；5：胃；6：肾；c:adv；阳性对照4腹腔注射Ad-ASmyc后在各组织内的分布情况讨论目前应用较多的adv载体为E1、E3区缺失的5型adv载体。E1区为adv复制所必需，其缺失导致复制缺陷，人们把这类载体称为第1代腺病毒载体。由于ad

20、v能高效转导目的基因，并在靶细胞内高水平表达，故adv在基因治疗领域内受到了越来越高的重视，随着研究的深入以及adv载体进入临床应用，人们对其安全性尤为关注。E1区缺失的adv载体已被很多实验证实其复制缺陷性14。Zhang等2分析了Ad-p53在靶细胞内的复制能力，发现即使感染率极高(MOI=1 000)，也检测不到病毒的繁殖和DNA复制。我们的病毒体外扩增实验结果表明：Ad-ASmyc无复制能力，在非包装细胞中不能繁殖。但也有人观察到在高感染率的情况下，E1区缺失突变的adv5及E1区缺失adv载体有一定的adv-DNA复制和低水平的基因表达5-8。c-myc作为生长因子的“立即早反应基因

21、”，其产物是细胞周期调控的最重要的转录因子9，是在G1期调控中参与细胞增殖和凋亡的“双功能因子”。在c-myc过量表达的细胞中，人为地急剧降低细胞中c-myc的浓度，会导致细胞凋亡10。我们构建的Ad-ASmyc感染BEL-7402细胞后，细胞生长受到了明显抑制，发生了明显的凋亡现象，而相同条件下，作为正常细胞的2BS细胞的生长并未受到影响。这表明，Ad-ASmyc 诱发的细胞增殖抑制和凋亡具有肿瘤细胞特异性，这可能是因为与正常细胞相比，癌细胞在细胞周期的正常调控方面的缺陷造成的。癌细胞需要更高水平基因产物来维持，降低这些癌基因产物的水平，就可能阻滞癌细胞的细胞周期，诱导其凋亡，而正常细胞则有

22、严密的细胞周期调控体系来维持。我们通过腹腔注射的方式，研究了Ad-ASmyc对小鼠机体的急性毒副作用，结果表明，不论应用治疗量(107 pfu)还是远高于治疗剂量的adv(109 pfu)，小鼠均无死亡及全身毒副作用的异常症状发生，仅在109 pfu剂量的小鼠肝脏组织内观察到有轻微的炎症反应，肝、肾功能与对照组相比亦无异常。Zhang等2、Brody等11、Rei等12用气管滴注的方式，分别观察了adv对小鼠、恒河猴和棉鼠机体的致病性，通过气管途径感染10101011 pfu病毒量，未发现动物有异常的临床症状，但组织学观察到肺出现剂量依赖性炎症反应。还有人在研究adv介导TK基因治疗口腔癌的实

23、验中观察到，当局部注射(口腔底部)2×109 pfu的adv时，远隔器官肝、肾、肺都有adv分布，但显微镜下观察，均未发现这些器官内有异常反应，所有动物的肝、肾功能和血细胞计数与对照组并无区别13。与代谢性遗传病等的基因治疗不同，Ad-ASmyc作为一种抗肿瘤药物，在未来的临床应用中将以直接瘤内注射为主要方式，Ad-ASmyc的瘤块内轻微炎症反应可能还会有一定的治疗效果。我们的研究表明：Ad-ASmyc 这一复制缺陷型重组腺病毒，在体外和体内的安全性都可得到保证，可以进一步进行与人类相似的灵长目动物实验及临床试验。基金项目：国家863高科技发展基金资助项目(Z20-01-02)作者单

24、位：张海增（中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院腹部外科，北京，100021）林晨（分子肿瘤学国家重点实验室）隗?（分子肿瘤学国家重点实验室）张雪艳（分子肿瘤学国家重点实验室）傅明（分子肿瘤学国家重点实验室）梁肖（分子肿瘤学国家重点实验室）邵永孚（中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院腹部外科，北京，100021）吴?（分子肿瘤学国家重点实验室）参考文献：1Roth JA, Christian RJ. Gene therapy for cancer：what have we done and where are we going. J Nat Cancer Inst,

25、 1997, 89：21-39.2Zhang WW, Alemany R, Wang JX, et al. Safety evaluation of Ad5CMV-p53 in vitro and in vivo. Human Gene Therapy, 1995, 6：155-164.3Levrero M, Barban V, Manteca s, et al. Defective and nondefective adenovirus vectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo. Gene, 1991,101：195-

26、202.4Ali M. The use of DNA viruses as vectors for gene therapy. Gene Therapy, 1994,1：367-384.5JonesN, Shenk T. Isolation of adenovirus type 5 host range deletion mutants defective for transformation of rat embryo cells. Cell, 1997,17：683-689.6Englehardt JF, Simon RH, Yang Y, et al. Adenovirus-mediat

27、ed transfer of the CFTK gene to lung of nonhuman primates： biological efficacy study. Human Gene Therapy, 1993, 4：759-769.7Rich DP, Couture M, Cardoza LM, et al. Development and analysis of recombinant adenovirus for gene therapy of cystic fibrosis. Human Gene Therapy, 1993,4：461-476.8Mittereder N, Yei S, Bachurski C, et al. Evaluation of the efficacy and safety of in vitro adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cDNA. Human Ge