细菌革兰氏染色与鉴定技术教案

1、食品检验工教学教案国家高等职业教育食品加工技术专业教学资源库子项目课程模块模块二 食品微生物检验基本技能训练实训项目细菌革兰氏染色与鉴定技术课时3教学对象食品检测专业授课日期教 材食品微生物检验技能实训教程主讲教师王瑞兰教学方法讲解、示范、指导辅助教师实验实训中心签字实训目的1. 掌握细菌标本片的制作2. 了解革兰氏染色的原理3. 掌握细菌单染与革兰氏染色技术4. 了解简单的无菌操作技术5. 进一步掌握普通光学显微镜的使用技术教学内容与要求一、 细菌涂片制作掌握细菌涂片的制作方法二、 革兰氏染色1. 了解革兰氏染色的原理2. 掌握革兰氏染色的操作技术重点难点教学重点：? 细菌涂片的制片? 革兰

2、氏染色? 油镜的使用技术教学难点：? 细菌涂片的制片? 革兰氏染色? 油镜的使用技术仪器普通光学显微镜试剂草酸铵结晶紫、卢哥氏碘液、番红、95%乙醇、香柏油/液体石蜡教学过程设计一、实训目的 (5min)1. 掌握细菌标本片的制作2. 了解革兰氏染色的原理3. 掌握细菌单染与革兰氏染色技术4. 了解简单的无菌操作技术5. 进一步掌握普通光学显微镜的使用技术二、实训原理（10min）革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。G+和G的细胞壁结构和成分的不同所决定的。（1）G细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、

3、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。（2）G+细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验材料u 设备：光学显微镜u 材料：金黄色葡萄球菌；大肠杆菌u 试剂：草酸铵结晶紫；卢戈碘液；番红染液；95%乙醇；香柏油四、实验步骤（60min）（一）细菌涂片制作1. 涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。2. 干燥 于空

4、气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。3. 固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。(二)革兰氏染色1. 初染：制片上滴加结晶紫染液，1min后水洗去剩余染料2. 媒染：滴加卢戈氏碘液，1min后水洗3. 脱色：滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。4. 复染：滴加番红液复染2min，水洗。5. 干燥：晾干或用滤纸吸干（三）显微镜检1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行高倍观察2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，移开高倍镜，在标本中央滴一滴香柏油，转换油镜，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。五、革兰氏染色结果判断与成绩评定兰紫色：革兰氏阳性菌红色：革兰氏阴性菌菌名颜色结果判断原因分析评分金黄色葡萄球菌大肠杆菌六、实训思考与讨论1. 涂片前为什么要点燃酒精灯？2. 革兰氏染色的关键是哪一步？为什么？ 注意事项1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2火焰固定时温度不宜过高，以免破坏菌体结构3. 在染色过程中，不可使染液干涸。4. 在革兰氏染色过程中脱色时间十分重