多肽类药物研究及应用进展

1、多肽类药物研究及应用进展 内容摘要：多肽是一类在氨基酸构成及其连接方式上与蛋白质相同,但在某些性质方面又有别于蛋白质的物质,如其空间结构较简单、免疫原性较低或无免疫原性、生理活性强等。但多肽类物质自身固有的特点，如口服利用率较低、酶降解性高以及半衰期极短等，使其作为药物开发应用受到诸多的局限。而导致多肽类药物不稳定的一个重要原因就是多肽特殊的分子结构。本文重点从分子结构改造方面对多肽类药物的研究进展做一综述。 关键词：多肽药物 结构改造 化学修饰 基因工程 环肽 多肽作为药物，具有生理活性强、免疫原性低、疗效高等诸多优点，随着生物技术的不断发展，其在人类疾病治疗中的地位也日趋重要，目前已成为国

2、际药学界研究的热点之一。但多肽类物质自身固有的特点，如口服利用率较低、酶降解性高以及半衰期极短等，使其作为药物开发应用受到诸多的局限。而导致多肽类药物不稳定的一个重要原因就是多肽特殊的分子结构，其中多肽主链氨基酸的降解和侧链氨基酸残基的结构变化是多肽结构不稳定的主要原因，因此从多肽类药物本身的分子结构进行改造，是改变其理化性质和药代动力学性质的根本。本文拟重点从分子结构改造方面对多肽类药物的研究进展做一综述。1 化学修饰化学修饰不仅是多肽类药物定向改造、提高稳定性的有力工具，也是研究多肽结构与功能的一种重要手段。对多肽的主链基团和侧链基团都可以进行化学修饰。主链基团修饰包括氨基酸肽链的延长、切

3、除及氨基酸定位突变等；侧链基团修饰主要集中于氨基、巯基和羧基上。修饰剂主要有葡聚糖、多聚唾液酸、聚乙二醇、四硝基乙烷等。根据修饰剂与多肽之间反应的性质，修饰反应可分为糖基化反应、酯化反应、酰化反应、取代反应、磷酸化反应、烷基化反应、氧化还原反应等。由于烷基化反应和氧化还原反应对多肽的活性影响较大，实际应用较少，而磷酸化反应对多肽稳定性的影响意义不大。现主要对前 4 种修饰反应进行重点介绍。1.1 糖基化反应糖基化是指多肽的氨基和单糖还原端的羰基在温和的条件下经过一系列变化成为较稳定的糖肽的过程，是一种较为理想的稳定多肽类药物的方式，糖链的存在及其结构的可变性、复杂性和多样性直接影响着糖肽在组织

4、中的降解和在体内的寿命1，也使得糖肽成为药学研究的新热点。脑内的亮氨酸脑啡肽可特异性地与阿片受体结合，在机体内起着调控痛觉感受并调节心血管与胃肠功能的作用，但半衰期短。1.2 酯化反应酯化是指多肽的羧基和醇羟基形成较稳定的酯类化合物的反应。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是常用的酯化反应试剂，是一种线性、亲水、灵活而不带电的高分子聚合物。通常选择相对分子质量大于 10 000 的 PEG 在温和的条件下对多肽进行修饰，选择合适的修饰类型、修饰程度以及修饰位点有利于改善多肽类药物的活性并提高其稳定性。目前已有不少经 PEG 修饰的多肽类药物如PEG-IL-22、PEG-

5、水蛭素3等已进入临床试验阶段。1.3 酰化反应酰化是指在多肽分子上导入酰基使之成为酰化肽的过程。酰化试剂多为氨甲酸、乙酸酐、酰氯等物质，经酰化反应修饰的多肽稳定性通常都有较大提高。在痛敏肽（nociceptin）的 N 端用氨甲酸修饰后，其活性和稳定性均有明显提高。把系列磷酸酯连接在与抗凝血肽相结合的白蛋白上，经耳缘静脉注射于家兔体内，结果显示抗凝血肽的半衰期延长了近 50 倍，但实验也表明，酰化肽常存在生物利用度不高等问题而影响其在多肽类药物中的推广使用。1.4 取代反应天然多肽由 L-氨基酸组成，稳定性较差。据此可以选择结构类似而对酶不敏感的氨基酸如 D-氨基酸、羟基氨基酸、甲基化氨基酸、

6、杂环氨基酸或烷基等取代相应的 L-氨基酸，通常既能减少对活性中心的影响，又能有效提高多肽类药物的稳定性。比较 D-型与 L-型的 螺旋抗菌肽 ，发现二者抗菌活性一致，但 D-型对胰蛋白酶不敏感，稳定性较好。在研究黑皮质激素受体拮抗剂中的一段序列 Ac-His-D-Phe-Arg-Trp 时，发现以氮杂环氨基酸取代 C 端 Trp 能有效抑制酶的降解，提高代谢稳定性4。而 在合成一种拮抗猫免疫缺陷病毒的八肽 Ac-Trp-Gln-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile 时，发现肽中 Trp-rich基序用适当长度的简单烷基替换后，其抑制活性和稳定性都有较大的提高。2 延长肽链延长肽链也称

7、分子末端修饰。稳定小分子线性肽链结构的驱动力主要来自主链与主链间及侧链与侧链间的静电作用，所以在一定肽链范围内从 N 端或 C 端延长肽链，可加强静电作用进而提高多肽的稳定性。例如，在酵母蛋白酶传染性因子（Sup-35）中的七肽片段 Gly-Asn-Asn-Gln-Gln-Asn-Tyr 的 N 端，逐级连接二肽或三肽片段，随着肽链的延长，所形成的寡聚物的稳定性也不断增强5。在神经六肽Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys 的 N 端和 C 端分别连接 D-Phe和 Thr 后，其活性和稳定性较天然六肽均明显增强。沿肽链骨架延长对酶不敏感或对热较稳定的氨基酸序列，从而抑制氨肽酶和羧

8、肽酶从 N 端或 C 端的降解，对多肽类药物和酶类药物稳定性的研究都有非常重要的意义。3 基因工程改变基因工程是近 30 年来发展起来的一项成熟的生物技术。利用基因工程技术将特定目的多肽与稳定性较好的蛋白质进行融合、表达和纯化，或者借助基因工程手段消除多肽中不稳定的残基，可达到改善多肽类药物结构稳定性的效果，提供具有医药意义的优良性状的蛋白质或多肽。基因工程技术应用于多肽药物研制,最基本的一条依据是,在机体内那些可用于医药目的的蛋白质或活性多肽都是由相应的基因决定的.它的最大好处在于,它有能力使被取出的基因在试管中剪切拼接、重新组合,进而被复制、扩增,生产出比原来要多数百倍、数千倍的相应的多肽

9、.据报道,应用基因工程手段筛选和开发新药,成功率为70%,仅需6年时间即可批准上市,传统方法成功率为50%,批准上市时间却需1015年.现在基因工程技术已使许多原来无法大量生产的多肽药物,如人胰岛素、人生长素、尿激素、凝血因子、干扰素、淋巴因子、白细胞介素、人红细胞生成素等,实现了工业化生产6.3.1 融合蛋白将稳定性与活性较好的蛋白质与多肽类药物进行融合，可以有效地提高多肽类药物的稳定性和活性。例如，酵母表达的血清白蛋白-干扰素- 融合蛋白（HSA-IFN-）在短尾猴体内的半衰期就比单独的 IFN- 延长了大约 18倍，若 HAS 和 IFN- 间借助 GGGGS 序列连接，则融合蛋白的稳定

10、性更强，同样的 HSA-CD4 融合蛋白在以家兔为动物模型的实验中半衰期比单独的 CD4 也延长了约 140 倍。但利用基因工程技术制备融合蛋白时需要考虑蛋白单体彼此间的结构关系，尤其是融合蛋白对活性中心的影响程度，否则可能出现稳定性提高而活性降低甚至丧失的结果7。3.2 诱变诱变是基因工程中研究基因表达、蛋白质结构和功能关系的有力工具，通过诱变技术替换多肽中不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，提高多肽的稳定性。诱变可分为定向诱变、随机诱变和 DNA 重组。如天蚕抗菌肽和蜂毒肽的杂种肽 Pep3，具有较强的抗菌活性，在研究中发现，用 Lys 和 Phe 分别替代 Trp 和 Val 后的

11、杂种肽 Pep3 类似物具有杀菌活性更高、细胞毒性更小和对蛋白水解酶敏感性更低的优点。但诱变前需要了解多肽的结构基序和功能基序，熟悉功能基序的变化规律，否则易导致诱变后维持多肽二级结构的各种作用力丧失而稳定性降低8。4 形成环肽环肽是相对于直线肽链而言的，具有生物活性的环肽通常具有明确的限制性构象，能够与受体很好地契合。由于分子内没有游离的 N 端和 C 端，环肽对于氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低。与直线肽链相比，环肽在抗真菌和杀灭肿瘤细胞等方面都表现出天然的优势。将直线肽链形成环肽，或者在具活性的直线肽链上连接一个环肽单元，往往可使多肽的活性和稳定性都得到明显提高。如细胞黏附肽 Arg-Gl

12、y-Asp 用于器官手术时，在促进增生方作用显著，但易降解及缺乏选择性，通过在该肽链上连接双吖乙二醇（diazaethyleneglycol）衍生物形成环状结构后，不但能同样抑制结合纤维蛋白原和纤维结合蛋白的能力，而且稳定性也有所提高。Arg-Gly-Asp-Val-Tyr 能抑制人白血病细胞K562 与纤维结合蛋白的黏连，在该肽链的两端借助 Cys 连接形成含二硫键的环七肽后，其抑制活性明显增强。根据环合方式，环肽可分为首尾相连环肽、侧链与侧链相连环肽、侧链与端基相连环肽、含二硫桥的环肽9以及其他桥连结构的环肽10。环合产物构象的改变，可使其活性发生较大改变。如胸腺五肽变为环状七肽后，活性明

13、显降低11。吗啡肽的环状类似物 H-Tyr-cD-Cys-Phe-CysNH2 与 H-Tyr-cD-Cys-Phe-D-CysNH2 分别是阿片受体 和 的拮抗剂，用二甲基（-CH2-CH2-）或顺二亚甲基（-CH=CH-）替代二硫键形成环肽后，其类吗啡肽的活性明显减弱。通过计算机模拟构象发现，肽链在环合前后构象变化越小，对直线肽链的生物活性保持就越有利，而应用侧链成环对肽链的构象影响最小，据此运用正交保护法合成了六元环肽，取得了理想的效果。总之，环肽独特的结构使之在多肽类药物结构稳定性的研究中备受关注，有广阔的开发和应用前景。5 结语目前，多肽类药物结构稳定性研究的新技术、新方法日新月异，

14、新成果也不断涌现。经化学修饰的多肽其分子性质发生了改变，在体内的作用时间延长，保留甚至提高了生物学活性，在很大程度上拓宽了多肽类药物的应用范围。但是，化学修饰也存在着修饰后药物活性降低、稳定性不够理想等突出问题，因此寻找合适的修饰位点，保持持续、有效的生物活性是多肽化学修饰未来研究的主要方向。通过延长肽链常能使小分子多肽的稳定性显著提高，所选择对象应是对酶或外界不敏感的氨基酸序列，但因其多用于小分子的多肽，所以适用围较窄。通过基因工程表达的多肽，在稳定性和活性方面常有意外收获，是新药研发的重要方向，具有广阔的市场前景，但融合多肽的表达量以及下游纯化技术还有待成熟，而通过化学修饰与基因工程相结合

15、，在提高多肽稳定性方面将会发挥更大的作用。对于环肽，应多考虑成环后结构的变化对多肽类活性的影响，寻找高效的环肽合成方法，努力做到准确地进行分子设计，以确保环肽的活性和稳定性。参考文献1朱立平. 蛋白质糖基化与 B 细胞免疫. 上海免疫学杂志, 2001,21(4):193-194.2Goodson RJ, Katre NV. Site-directed PEGylation of recombinant382 中国医药生物技术 2007 年 10 月第 2 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2007, Vol. 2, No. 5interleukin-2

16、at its glycosylation site. Biotechnology, 1990, 8(4):343-346.3于爱平, 蒋中华, 钟根深, 等. 聚乙二醇修饰水蛭素的分离纯化与活性分析. 药物生物技术, 2004, 11(5):302-305.4 陈贯虹,迟建国,邱维忠,王加宁,孙元军. 多肽药物的研究进展J山东科学, 2008,(03) 。5Zheng J, Ma B, Tsai CJ, et al. Structural stability and dynamics of anamyloid-forming peptide GNNQQNY from the yeast prion sup-35.Biophys J, 2006, 91(3):824-833.6熊仁平.生物技术及其在医药上的应用J.中国药业,1997,7:27.7唱韶红, 巩新, 杨志愉, 等. 人血清白蛋白和人干扰素2b 的融合蛋白在毕赤酵母中的表达. 生物工程学报, 2006, 22(2):173-