遗传分析的一个基本原理是DNA的物理距离和遗传距离方面...

1、7.28 春季 2001考试二1#姓名问题1/30分问题2/20分问题3/25分问题4125分总共/100分#问题1. （30分）1A （6分）遗传分析的一个基本原理是 DNA的物理距离和遗传距离方面的距 离（举例来说，在一张遗传图谱上的距离）在整个的基因组上通常是成比例的。虽然 一些区域不寻常地表现出或高或低的重组频率，基因组的所有区域都能够参与同源重组。基于你对同源重组机制的认识，列出两个能够用来使所有的DNA序列都参与同源重组的过程的特点。并解释你的答案。特点1: （3分）同源重组的其实是不依赖于DNA序列的。使一个双链 DNA解链的可能性在整个DNA分子中都是一样的。特点2: （3分）

2、修整DNA解链现象的元件是结构专一性的，不依赖于序列。 RecBCD将转载到任何一个松散的 DNA双链的末端，RecA将转载到任何一个单 链DNA区域。注意:过分强调Chi位点在这道题中并不正确。因为当你离开 Chi位点后，重组 频率仍会改变。请阅读以下实验内容，然后回答问题。虽然重组频率在整个染色体上是相当一致的，针对特定的染色体区域的详细分析表 明那一些区域存在着远高于一般的重组频率 ，而其他区域重组频率要低得多。你决 定在大肠杆菌中研究这种现象，以揭示负责这些“热点”与“冷点”区域的分子机 制。实验步骤的设计如下所示。你通过进行噬菌体调谐的转导在染色体的 8个区域检测 同源重组的频率。受

3、体菌有多种营养缺陷型标记，意味着在8个区域中的每一个区 域，都有一个缺陷基因。供体菌则有这些缺陷基因的野生型等位基因。受体菌： his-, trp-, lac-, ara-, val-, leu-, thi-, ura- 供体菌：his+, trp+, lac+, ara+, val+, leu+, thi+, ura+转导的噬菌体生长在供体细胞上，噬菌体随机地包装供体细胞染色体基因组50kd区域。这些噬菌体再用来转染受体细胞，因此将供体细胞的染色体区域介导进去。 如果在外来 DNA和受体宿主细胞染色体之间的重组是成功的，那么，受体细胞将 获得一个野生型的等位基因。下面是就每一个染色体定位上观

4、察到的重组频率表。表1野生型重组子的频率:区域1His+0.2 %区域2Trp+0.2 %区域3Lac+0.02 %区域4Ara+0.2 %区域5Val+0.02 %区域6Leu+0.6 %区域7Thi+0.2 %区域8Ura+0.2 %为了探究重组频率或高或低的机制，你决定更详细地研究区域1,3,5,和6。为了做到这一点，你重复了相同类型的体内重组分析。这一次与前面不同的是，受体菌在 以下位点还带有一个突变：recB，recD 或ruvC。下面是反映实验结果的一张表格。 在每一个实验中，野生型重组的频率（举例来说 His+代表区域1）如表一所示。表2:野生型重组子的频率:在受体菌中的突变re

5、cBrecDruvC区域1<0.001%0.6%<0.001%区域3<0.001%0.12%<0.001%区域5<0.001%0.6%<0.001%区域6<0.001%0.6%<0.001%1B（4分）.基于这些发现，就表1中区域5观察到的异常重组频率，建议一 个可能的机制。列出你模型的实验证据。（2分）相比于其他区域，区域 5有一个低数量的chi位点，或者比其它区域更 远离chi位点。（2分）实验证据如表2所示。在一个recD突变体中（不再对chi 位点产生应答），重组频率甚至与其他区域同样的水平。1C（4分）.就表1区域6中所显示的异常高的重

6、组频率，给出一个可能的机制列出你模型的实验证据。（2分）相比于其他区域，区域 6有一个高数量的chi位点。或者比其它区域更靠 近chi位点。（2分）这方面的实验证据如表 2所示。在一个recD突变体中（不再 对chi位点产生应答），重组频率保持不变。1D（10分）为了更进一步探究机制，你从区域5中分离了一个15 kb片段，从区域 6中分离了一个15 kb片段。使用纯化的 RecBCD酶系统在体外混合这两种 DNA 片段进行反应。请图示 DNA底物（表上重要的特征）和 DNA产物，你的图示应该 大致成比例。没有必要画一块胶，仅仅用一条线代表 DNA即可。如果最终RecBCD 酶系统产生的DNA产

7、物是RecA的适宜底物，请再画一张图，表明 RecA结合的位 置。完整的图应包含以下内容：底物:15kb平端双链DNA。指出5'和3'端。区域5或者很少有chi位点，或者Vai Marker 远离chi位点。区域 6或者含有较多的 chi位点，或者 Leu Marker 靠近chi位点。产物：与上相同，但是一个 3单链尾巴将被 RecBCD产生。RecA应该被加载到 这个单链区域。1E（6分）.完成对区域5和6的分析，你转回研究区域 3。因为无法解释在区 域3所观察到的低的重组率，你和你的实验室伙伴讨论， 看看他们是否有好的主意。 一个聪明人建议你，立即检测受体菌中lac-突变

8、位点附近的基因组序列。假定测序是可行的，你认为这是一个好主意。你的朋友建议你找的是什么序列特征呢？这个 序列特征对解释你观察到的重组频率数据有什么贡献呢？（3分） 你会寻找RuvC 致序列，因为这些位点将会阻止分支迁移通过Lac编码区域，从而抑制那个区域的重组。（3分）RuvC 致位点应该在 Lac编码区域附近。注意:答案不能是chi位点一致序列。因为相比于其他区域，recD突变体的重组 频率仍然较低。问题2（20分）你正在研究细菌获得并保持抗生素抗性基因的机制。你手头上正在研究的是一个对氨苄青霉素有高度抗性的菌株（被命名为728A），在含有氨苄青霉素的平板上能够 100%地形成细菌菌落。知道

9、质粒和转座子常常带有抗生素抗性基因，你分析 728A菌株，发现它含有一个 质粒。为了研究这个细胞保持质粒的机制，你把这个菌株进行突变，分离到一个变 异体（命名为728B），它丢失了氨苄青霉素抗性表型的频率较高。当728B的液体培养物被涂布在含有氨苄青霉素的平板上，仅仅10- 15%的细胞长出菌落。为了调查728B氨苄青霉素抗性质粒遗传性下降的原因，你从 728A和728B细胞培 养物中纯化出质粒 DNA，在琼脂糖凝胶中分析 DNA。凝胶分析分别在用 EcoRI处 理DNA之前和之后进行，EcoRI在DNA上仅仅有一个酶切位点。728 A728BEcoRI:1 1-+111 1-+11Aitid

10、Rolasmid a el2A （4分）.基于这一项分析,728 B 细胞在氨苄青霉素抗性平板上抗性效果下降的 合理的解释是什么？如果质粒在复制后经历了同源重组，它们形成多聚体，那么可以通过位点专一性 重组被分离。如果它们没被分开，那么，当细胞分离后，仅有一个子细胞接受含 有氨苄青霉素抗性基因的质粒。从728B中分离的质粒存在单体、二聚体、三聚体和四聚体形式的话，当用EcoRI作用时，因为它在每个质粒上仅有一个切点，它们全部都应该呈现出相同大小的一条电泳带。因此这个现象的原因应该是重组酶有突变或者是它识别的位点有突变。注意虽然一个复制的转座子会形成cointegrant ,它比最初的质粒大,因

11、为复制的转座子增加了额外的长度，它不会切回原来的大小。2B （6分）进一步的分析728 B细胞表明突变导致质粒DNA的遗传性大大降低。 而且，这个基因编码一个反式作用元件 。简要描述一个或两个支持这个结论的实验 证据。在这里，虽然有许多可能的实验，你必须检测质粒的遗传性，而不能单单检测启 动子的转录。例如，用从野生型 728A中提取得到的质粒转化 728B细胞，用另一个标记物, 比如卡那霉素抗性基因。如果突变在质粒上(顺式元件)，那么这个新的质粒将 被保留，细胞将表现出对卡那霉素的抗性。如果它编码一个反式作用元件，细胞 将对氨苄青霉素表现抗性。或者讲出质粒上的突变，你可以用从728B从提取的突

12、变质粒去转化野生型的菌株，这个质粒的保留性差。你还得再提出一个实验方案来证明它是一个反式作用元 件。2C(6分)假定试验结果如PartA和PartB中所示，你提出一个假设，有关于在728B 细胞中突变的蛋白的类型。你决定使用一个生物化学方法分离纯化这个野生型的蛋 白质。请描述:(1) 纯化蛋白后你所使用的分析方法；(2) 你会使用什么细胞作为原材料；(3) 假定你有任何进行分析所需的小分子量辅助因子。分析：把从728 B细胞中分离的质粒和细胞提取物混合在一起进行反应，然后检测是否存在大分子聚合物(大分子量的条带)，请注意生化方法本身并不是你说 应指出的全部分析内容。你还需要指出一个分析的方法，

13、在该分析方法中，突变 细胞的提取物不能表现出相应的功能，而野生型蛋白质则可以。最初的材料：728A细胞提取物，从中提取野生型蛋白质。辅助因子：如果你针对的是重组酶，并不需要什么辅助因子。2D（4分）在你进行蛋白质纯化时，你回过头运用遗传学方法来解释质粒保留的机制。因此，你决心试一试，看看是否能分离到一个突变，它能够抑制728B的表型为了大大目的，你开始培养728B细胞，突变这些细胞，并筛选突变，看看它是否能够在含有氨苄青霉素的平板上100%的表现抗性。你成功地筛选到一个这样的菌株，并把它命名为728C。这一次，这个突变是位于细胞的染色体上，而非质粒上。试推测出位于728C细胞中一个细胞染色体上

14、的基因， 它能够导致这种现象的出现。 并请予以解释。涉及到同源重组的一个基因，比如RecA/B/C/D。质粒的多聚体化是通过质粒间的同源重组现象引起的。如果你的假定是正确的，你还期望728C细胞表现出什么其他表型?728C细胞将对引起双链解链的因素敏感，比如X-射线。问题3（25分）你正在研究一个对老鼠生理节奏控制十分关键的基因，称作Earlyto Bed （简称ETB）。使用启动子突变定位和突变启动之体内分析技术，你已经鉴 定出两个关键的转录激活子的结合位点，这两个因子诱导老鼠睡眠。你把这两个因 子叫作SNZ1禾口 SNZ2。你纯化并克隆了 SNZ1和SNZ2，来鉴定它们是否刺激转录。使用g

15、el shift assay（凝胶印迹技术），它们每一个都可以独立结合到EBT启动子上，对另一个结合启动子没什么效应。你首先检测了它们的体外转录激活活性，通过把纯化的激活因子加入 到含有EBT启动子的质粒、纯化的 RNA聚合酶II，以及其他辅助因子（TFIIA ， TFIIB ，TFIID ，TFIIE ，TFIIF禾口 TFIIH）的反应体系中。你得到的结果如下所示：激活剂体外转录单位没有SNZ1SNZ2SNZ1+SNZ2200050 UU50 U2000 U3A（6分）建议两个机制，针对 SNZ2的体内作用效应，来解释 SN2在体外分析中 没有表现出的对转录的激活。 假定你所使用的纯化的

16、SN2是正确折叠的，能够结合 到DNA上，能够正常行驶生物功能的。i）与 ii）有许多可能的答案。它们都涉及到一些条件，这些条件在体外实验中不完全具备， 但在体内作用时却是有的，比如一个辅因子，像Ca+，个修饰，像磷酸化修饰，或者使SN2恢复活性所需的蛋白质激活剂。我们在这里寻找的真正答案是关于核染色质的。在体内，染色质对真核细胞转录 是起到抑制的作用的。在体外实验中，质粒DNA上没有染色质结构。SN2作为一个组蛋白乙酰转移酶，或是一个染色质改构因子而激活转录的。3B（3分）为了进一步阐述SNZ2为什么在体外实验中不表现激活效应，你决定 定位SN2激活结构域。描述一个实验方法，用来达到这个实验

17、目标。为了定位一个活性结构域，把一个 DNA结合结构域比如 LexA融合到SN2 上，以及做一系列的 SN2删除突变体。基于 LexA及报告基因LacZ，检测这些 删除突变体在体内对启动子的效应。可以预计，发现对转录激活是必需的区域后，你可以一个一个地检测以确定这些区域（对转录激活）是否是充分需要的。你最初检测了一个启动子，它没有 SN2结合结构位点，但是你发现，在EBT的启动子上需要有 SN2的结合位点，以及 SN2DNA结合结构域，才能观察到转录 激活。3C（5分）在这些条件下，你如何继续进行针对SN2激活结构域的分析？请描述激活结构与定位实验存在的局限性。理想情况下，做凝胶转印实验来检测

18、 SN2的哪一个区域对结合 DNA是必需 的。基于带有SN2结合结构位点和报告基因的测试启动子，检测 SN2删除突变 对转录激活的效应。这些实验可能会让你检测到 SN2上激活必需区域，而非DNA 结合区域。但是不太可能让你检测到对激活来说是完全充分的区域。3D（3分）.使用你在3A部分中设计的两个模型中的一个，你如何解释SN2DNA结合结构域对其体内转录激活效应的重要性？如果SN2重新恢复染色质改构分子或 HAT功能，它结合核小体 DNA的能力是 非常重要的。大多数 DNA结合蛋白，比如LexA，做不到这一点。有必要解释一下为什么简单地使用其他蛋白质恢复针对启动子的激活功能，比如LexA，却不

19、奏效。例如，SN2在其结合位点可以和其它因子结合并协同作用， 以激活转录。3E（8分）你如何修正最初的体外转录分析实验，以观察SN2的效应？描述检测转录必需的所有元件以及分析方法。-使质粒DNA核小体化。（并不包括在体外如何进行操作）-加入染色质改构因子和 ATP，或者HAT。-通过转膜印迹或凝胶电泳，监测整合入放射性标记的 UTP，分析转录情况。（注 意在这里所提问的问题是你如何检测转录，而不是你如何监测染色质是否被改 构）使用其它模型进行分析也是可取的，只要过程完整，包括进去上面A部分体外转录实验中所缺少的元件。问题4（25分）你最近参加了 Ann Hochchild's的实验室，

20、想继续将所了解的 Simon Dove的试验工作做下去。你特别想了解启动子和蛋白质在体外的功能。你制备了一些质粒 DNA，这些质粒DNA有的具有野生型Prm，有的质粒DNA 的Prm有在作业中提到的额外-35个碱基。在有或没有 a-s70嵌合蛋白的情况下， 检测lcI的Sa109强激活类型在刺激转录方面的活性。基于一个简单的转膜印迹结 合实验，你得到如下试验结果：#lcI蛋白质RNAP转录（每秒钟计数）野生型Prm附加的-35Prm1没有WT25 CPS25 CPS2lcI(Sa109)WT250 CPS25 CPS3lcI(Sa109)70 a-s25 CPS100 CPS你观察到，含有RN

21、AP和35PRM的lcI（Sa109）诱导效应很差（第3号实验），你对其感到很好奇。你想检测一下，在两个激活组合中的最初阶段什么步骤被激活 了？（含有野生型 Prm的第2号实验和含有-35Prm第3号）4A（4分）描述一下你如何检测在起始阶段，当加入lcl（Sa109）激活因子后，什么步骤被激活。（1分）为了检测起始过程的哪一步被提高，你必须在存在或不存在激活剂时， LcI（Sa109），对下列每一种条件下进行分析：（1分）为了分析带有野生型或嵌合型RNAP及相应启动子的关闭态复合体，进行一个凝胶转印或DnaseI保护分析。（1分）为了分析带有野生型或嵌合型RNAP及相应启动子的开放态复合体，

22、进行一个 DNA Unwinding 分析。（1分）为了分析三重复合体构成/启动子清除，使用放射性标记的核酸进行一个标 准的 Incorporation 分析。4B（6分）画出你期待的结果，如果lcl（Sa109）蛋白质激活了带有野生型 RNAP 和PRm的开放态复合体以及带有嵌合型 RNAP和修饰的Prm的关闭态复合体（你只 需画出发生激活现象时的分析结果图就行了）野生型RNAP和PRm嵌合型 RNAP/修饰的PrmlcI(SalO9) + WT RNAP +-+ lcI(SalO9)-+ Chimeric RNAPRadiolabelled modified Prm12#RNAP和修饰的P

23、rm），incorporation 分析，但在你不感到惊讶的是关闭态复合体的激活情况（带有嵌合型 但是你想研究一下，激活水平较低的原因。你进行了一个 变性凝胶上分析实验结果。你获得了如下的分析结果：RNA 卩 WT <xo7()Promoter WT Prm 2X -35 PrmXcl( Sal 09)+1500 bases600 bases300 bases20 bases3000 bases1234C(6分).建议一个存在嵌合型 RNAP和修饰过的PRM的情况下lcl(Sa109)激 活机制，解释在第三道和第四道中观察到的，弱转录对应的较强的放射性感光效应 和全长转录产物对应的较弱的放射性感光现象