反复肺炎支原体肺部感染大鼠肺组织中碱性成纤维细胞生长因子mR

1、    反复肺炎支原体肺部感染大鼠肺组织中碱性 成纤维细胞生长因子mRNA的表达        【摘要】目的探讨反复肺炎支原体肺部感染大鼠肺组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达的变化。方法将8只大鼠于24周内反复9次经超声雾化吸入肺炎支原体以复制其慢性肺部感染模型，另以4只为对照，随后用bFGF cDNA核酸探针行核酸分子原位杂交及定量像分析，观察肺组织bFGF mRNA表达的变化。结果(1)感染组动物(4只)支气管肺泡灌洗液肺炎支原体-聚合酶链反应

2、(PCR)检测均为阳性，而对照组(4只)和感染加红霉素治疗组动物(4只)均为阴性(P<0.05)；三组动物的支气管和肺组织常规细菌培养结果均为阴性；感染组动物透射电镜检查见肺泡间隔增宽，其中有较多胶原纤维堆积，其余两组则未见明显异常。(2)感染组动物肺泡壁见明显的bFGF mRNA阳性表达颗粒，对照组基本未见bFGF mRNA阳性表达，感染加红霉素治疗组仅见散在分布的少许bFGF mRNA阳性表达；定量分析结果表明，感染组bFGF mRNA阳性表达的积分吸光度为41.32±10.44，与对照组(0.30±0.13)和感染加红霉素治疗组(6.03±2.41)比

3、较，差异有显著性(P<0.01)。结论反复肺炎支原体肺部感染可使肺组织bFGF mRNA表达上调。提示bFGF可能参与反复肺炎支原体肺部感染致肺间质纤维化的发病过程。【关键词】肺炎支原体肺间质纤维化碱性成纤维细胞生长因子mRNA expression of basic fibroblast growth factor in the pulmonary tissues from rats repeatedly infected with mycoplasma pneumoniaeLIU Jian, PENG Dongxin, ZHU Zhaoxia, et al. Department o

4、f General Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan, 430030【Abstract】ObjectiveTo investigate changes in mRNA expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in pulmonary tissues from rats repeatedly infected with Mycoplasma pneumoniae (MP). MethodsRats were infected with MP for

5、 9 times during a period of 24 weeks by ultrasonic nebulizing inhalation to establish animal models of chronic pulmonary MP infection. In situ hybridization was performed with bFGF cDNA probe and results were quantitatively analysed to measure the changes of bFGF mRNA expression in lung tissues. Res

6、ults(1) MP polymerase chain reaction (PCR) tests showed positive results in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) from MP infected animals (n=4) while results were negative for BALF from the control rats (n=4) and rats infected with MP but treated with erythromycin (n=4). Bacterial cultures of the

7、 bronchial and the lung tissues were negative in all three groups. Observation with transmission electron microscope showed that interalveolar septa were widened with increased amount of collagen in the MP infected rats while there were no obvious abnormalities in the other two groups. (2) Positive

8、expression of bFGF mRNA were found in alveolar walls of MP infected rats. No expression of bFGF mRNA was found in control animals. In the rats infected with MP but treated with erythromycin positive expression of bFGF mRNA was found to be scarcely distributed in alveolar walls. Quantitative analysis

9、 showed that the optical densities of bFGF mRNA expression were 41.32±10.44 in the MP infected rats (n=4), which were significantly higher than those in the control group (0.30±0.13, n=4, P<0.01) and those in the MP infected and erythromycin treated rats (6.03±2.41, n=4, P<0.01)

10、. ConclusionsRepeated pulmonary infection with MP can lead to up-regulation of bFGF mRNA expression, which suggests that bFGF might play a role in the pathogenesis of pulmonary interstitial fibrosis after repeated MP infection.【Key words】Mycoplasma pneumoniaePulmonary interstitial fibrosisBasic fibr

11、oblast growth factor以往研究表明，反复肺炎支原体肺部感染可致肺间质纤维化1。但其形成机制尚不清楚。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有强大的促进细胞分裂增殖的作用2，是有关各种原因所致肺间质纤维化形成机制研究的重点对象。我们应用组织原位杂交技术，观察反复肺炎支原体肺部感染大鼠肺组织中bFGF mRNA的表达是否增加，以探讨bFGF在反复肺炎支原体肺部感染致肺间质纤维化的发病机制中的作用。材料与方法一、菌种和bFGF质粒1.肺炎支原体标准液：浓度为1034 ccu/ml，由首都儿科研究所提供。2.载有人bFGF cDNA片段的质粒由美国屈正宏博士惠赠。二、动物选择、分组与饲

12、养清洁级成年Wistar大鼠12只，雄性，体重(200±10) g，由同济医科大学实验动物中心提供。随机分为正常对照组、肺炎支原体感染组(感染组)和肺炎支原体感染加红霉素治疗组(治疗组)，每组4只。对照组动物与其余两组动物分别饲养在同一楼层空气互不流通的两个房间内。其余饲养条件完全相同。三、动物感染方法肺炎支原体肺部感染组大鼠放入自制的实验箱中，取肺炎支原体标准株液15 ml，放入经消毒的超声雾化机(上海市合力医疗器械厂)的湿化瓶中，加入0.9%无菌生理盐水15 ml。将雾化气体送入实验箱内，箱内氧浓度保持在21%，雾化20分钟。在24周内间隔不同时间(最短间隔7天，最长间隔39天)

13、感染共9次。治疗组感染方法与感染组完全相同。另用0.6%红霉素溶液5 ml/kg腹腔注射，每日1次(其余两组腹腔注射生理盐水)，4周为一个疗程，隔1周再行下一个疗程。正常对照组用不含肺炎支原体的无菌培养液15 ml，放入经消毒后的超声雾化机的湿化瓶中，加无菌生理盐水15 ml，用同样的方法雾化吸入。四、支气管肺泡灌洗液(BALF)肺炎支原体-聚合酶链反应(PCR)检测动物麻醉(3%戊巴比妥钠0.15 ml/100 g体重，腹腔注射)后，按无菌操作游离出气管，注入无菌生理盐水约2 ml灌洗，反复3次。BALF送肺炎支原体-PCR检测。五、支气管和肺组织细菌培养大鼠经颈动物放血处死，立即在无菌操作

14、下行开胸术，取左主支气管和左下肺组织各2块(2 mm×1 mm×1 mm左右)，分别行常规细菌培养。六、bFGF mRNA原位组织杂交1.组织取材：动物处死后，立即在左下肺取组织1块，按电镜检查标本常规处理，用于透射电镜检查。随后将心肺完整地从胸腔中取出，结扎左主支气管，气管插管后，经气管缓慢注入10%中性甲醛溶液，待肺膨胀至胸膜平展后，结扎气管，再将全肺浸泡于10%中性甲醛溶液中固定3天，取右下肺组织行常规石蜡包埋。2.探针制备：载有人bFGF cDNA片段的质粒pGEM4Z/hb270，扩增后用EcoR/pst切下270 bp人bFGF cDNA片段。地高辛DNA标记和

15、检测盒购自德国Boehringer manheim公司，按其说明标记bFGF cDNA探针。3.核酸原位杂交：方法与文献所载者相似3。具体步骤为：(1)切片脱蜡，水化2次×5分钟；(2)0.2 mol/L HCl常温20分钟，双蒸水洗2次×5分钟；(3)0.01 mol/L PBS含5 mmol/L MgCl2浸透处理2次×10分钟；(4)蛋白酶K 40 mg/L 37 20分钟；(5)0.2%甘氨酸/PBS室温2次×10分钟；(6)4%多聚甲醛后室温固定20分钟；(7)0.01 mol/L PBS 2次×10分钟；(8)70%甲酰胺/2

16、15;SSC 70，10分钟；(9)预杂交42 2小时，预杂交液含5×SSC 50%去离子甲酰胺，5×Denhardt液，100 mg/L变性鱼精DNA，10%硫酸葡聚糖；(10)倾去预杂交液，滴杂交液(预杂交液+预先煮沸变性的bFGF cDNA探针)1020 l于切片，加硅化盖玻片，液体石蜡封片，置预热的铁板上95 5分钟，-20速冻置35分钟；(11)恢复室温后，置含2×SSC液盒中42杂交36小时；(12)100%乙醇泡去盖玻片及液体石蜡；(13)2×SSC 2次×5分钟；(14)0.1×SSC 2次×15分钟；(15

17、)Buffer 4次×5分钟；(16)Buffer，37封闭1小时；(17)加11000抗Dig抗体复合物371小时；(18)AV-AP酶联缓冲液16 mg/L，37 1小时；(19)Buffer4次×5分钟；(20)Buffer 2次×2分钟；(21)显色24小时；(22)TE终止显色，水洗；(23)1%爱新蓝染色1小时；(24)水洗，伊红衬染；(25)脱水透明，封片。各组均设空白对照切片，不加变性探针，其余步骤与实验切片完全相同。七、像分析应用TJTY-300型医学像全自动处理系统行像分析。每只大鼠的切片随机选取10个高倍视野，分别测定其中阳性染色的积分吸光度

18、，求其均值，作为该大鼠的测定值。八、统计学方法两组间计数资料差异的显著性用四格表精确检验法检验，计量资料差异的显著性用t检验法检验。结果肺炎支原体感染组大鼠的BALF中肺炎支原体-PCR检测均呈阳性结果，而正常组及治疗组动物均为阴性(P<0.05)。三组动物支气管及肺组织常规细菌学培养均为阴性结果。透射电镜观察正常组及治疗组动物肺组织未见明显异常；感染组动物肺组织见肺泡间隔明显增宽，并可见较多胶原纤维堆积(1)。1感染组动物增宽的肺泡间隔内见较多胶原纤维堆积EM×3 150bFGF mRNA原位杂交阳性表达为棕黄色颗粒。三组动物的空白对照切片均未见阳性颗粒。正常对照组动物实验切

19、片内未发现具有明显的棕黄色阳性颗粒细胞(2)，感染组大鼠肺组织实验切片中见肺泡壁有明显的棕黄色的bFGF mRNA阳性表达颗粒(3，4)，治疗组动物仅见肺泡壁有少许阳性表达颗粒(5，6)。定量分析结果表明，感染组(4只)bFGF mRNA阳性表达的积分吸光度为41.32±10.44，与正常对照组(4只，0.30±0.13)及治疗组(4只，6.03±2.41)比较，差异有显著性(P<0.01)。2对照组动物肺组织内未见bFGF mRNA阳性表达cDNA-mRNA原位杂交×4003，4感染组动物肺泡壁见明显的棕黄色的bFGF mRNA阳性表达颗粒cDN

20、A-mRNA原位杂交×4005，6治疗组动物肺泡壁仅见散在分布的少许棕黄色的bFGF mRNA阳性表达颗粒cDNA-mRNA原位杂交×400讨论肺炎支原体肺部感染在全世界发病率均很高，彭东信等4以往的调查结果表明，肺炎支原体肺部感染是慢性阻塞性肺疾病急性发作的重要原因之一。以往一般认为，肺炎支原体肺炎病情轻，对肺组织不会造成持久的器质性损害，但近年的研究工作却发现，反复肺炎支原体肺部感染的动物模型肺组织中可见肺间质纤维化的病理变化1，本组研究工作在透射电镜下亦见反复肺炎支原体感染组大鼠肺间质中有较多胶原纤维堆积。但其形成机制尚未见报道。阐明该问题有助于全面地完整地认识肺炎支原体肺部感染的危害性，有助于阐明许多慢性阻塞性肺疾病患者肺部类似于纤维化病变的发生机制，有助于提高临床对肺炎支原体肺部感染的防治水平。肺泡型上皮细胞、肥大细胞、血管平滑肌细胞等均可表达bFGF mRNA，进而合成bFGF蛋白质5。bFGF蛋白质正常时主要位于肺泡壁上皮细胞基底膜内，与硫酸肝素糖蛋白相结合。当受到有关的刺激时，它受蛋白酶作用而释出，发