LPZQL和PZQL的研制及其抗小鼠的日本血吸虫病活性的比较

1、    LPZQL和PZQL的研制及其抗小鼠的日本 血吸虫病活性的比较        提要以提取的大豆卵磷脂为膜材，采用逆相蒸发法制备了左旋吡喹酮脂质体(LPZQL)和吡喹酮脂质体(PZQL)。用AC 920红细胞分析仪和扫描电镜检测显示：LPZQL和PZQL粒径大部分为24 m，主要为大单层脂质体，对LPZQ和PZQ包裹率达98%以上。用LPZQL，PZQL和PZQ对感染日本血吸虫病的小鼠进行灌胃治疗，探讨了两种脂质体对小鼠抗日本血吸虫病的活性。动物实验表明：LP

2、ZQL疗效较PZQ高4倍；PZQL疗效较PZQ高2倍。脂质体作为靶向制剂，降低了LPZQ和PZQ的治疗剂量，提高生物利用度，可望成为抗日本血吸虫病的新剂型。关键词左旋吡喹酮吡喹酮脂质体日本血吸虫病 PREPARATION OF LIPOSOME OF LEVO-PRAZIQUANTEL ANDPRAZIQANTEL AND THEIR COMPARATIVE EFFICACY INEXPERIMENTAL THERAPY OF SCHITOSOMIASIS IN MICEYu YuYan ShenheHu XianglanJin HongweiWang Xiaogen*Zhuo Chao*(R

3、esearch Laboratory of Pharmaceutical Chemistry and Biomaterials,Institute ofInfectious and Parasitic Diseases*,Chongqing University of Medical SciencesChongqing 400016)ABSTRACTLPZQ or PZQ were encapsulated in liposomes. The diameter of LPZQL and PZQL with large unilameller vesicles were about 2-4 m

4、detected by AC920 red cell analyzer and scanning electron microscope. Encapsulation efficiency of liposome to LPZQ and PZQ was over 98%. The experimental therapy of Schitosomiasis japonica in mice for the comparative efficacy of LPZQL, PZQL and PZQ showed that the efficacy of LPZQL and PZQL were hig

5、her 4 and 2 times than that of PZQ,respectively. These results indicated that LPZQL and/or PZQL may be developed to a new type of anti-schitosomiasis japonica preparation.Key WordsLevo-praziquantel(LPZQ)Praziquantel(PZQ)Liposome preparationSchitosomiasis Japonica血吸虫病为世界流行性的寄生虫病之一。吡喹酮(praziquantel, P

6、ZQ)以其高效低毒的特点作为治疗血吸虫病的首选药物，已在全世界广泛应用于人畜血吸虫病的治疗1，2。近年，已研究了PZQ及其旋光异构体的合成、药理和临床应用，确证其左旋体是主要的抗血吸虫成分，右旋体几乎无杀虫作用3，对心脏的毒性左旋体比右旋体低2。左旋吡喹酮(levo-praziquantel,LPZQ)灌胃给药的药动学实验表明，其在肝脏有很强的首过效应，代谢速度快，血药浓度低，其生物利用度仅4.7%4。消旋体也有类似情况。灌胃给药不能充分发挥该药的作用，改变LPZQ和PZQ药物的剂型或给药途径，望能降低给药剂量，提高生物利用度。脂质体(liposome)对肝脏具有定向性，作为药物的载体研究已取

7、得重要进展，并且不断扩大应用领域5，有报道6，用PZQL腹腔注射后，0.516 h的血药浓度和肝、脾组织内药物含量均明显较PZQ其它普通剂型的相应浓度高，半衰期显著延长。PZQL的口服急性毒性LD50为3 372 mg/kg，比PZQ口服急性毒性LD50的2 454 mg/kg低约1/4。因此，拟利用脂质体的特点采用灌胃给药方法，当经过肝脏时，具有保护LPZQ和PZQ少发生或不发生首过效应，而定向到达靶区，发挥其作用。现特对左旋吡喹酮脂质体(LPZQL)和吡喹酮脂质体(PZQL)进行研制和对小鼠抗日本血吸虫病的活性进行研究。1材料及仪器1.1材料与试剂LPZQ(自制，批号880801，D-14

8、9°(25，C1，氯仿)；PZQ(上海第六制药厂)；豆磷脂(自制)；内标物(2-苯甲氧羰酰-1，2，3，6，7，11b-六氢-4H-吡嗪并2，1-a异喹啉-4-酮，自制)。磷酸钠缓冲溶液：137 mmol/L NaCl2，2.6 mmol/L KCl，6.4 mmol/L NaH2PO4，1.4 mmol/L Na2HPO4，pH7.4，使用时用二次重蒸馏水稀释。1.2仪器LC-6高效液相色谱仪(日本)；超声波清洗器(上海超声波仪器厂)；Diskboy kurabo FB-4000微型离心机(日本)；0.2 m微孔薄膜；85-2型旋转蒸发仪(上海)；Kyky(Amray)-1000B

9、扫描电镜(中国科学院科学仪器厂)；AC920红细胞分析仪(瑞典)。1.3实验动物100只BALB/c小鼠(各半)，体重1822 g(重庆医科大学实验动物中心)。日本血吸虫尾蚴(四川省寄生虫研究所)。2实验方法与结果2.1LPZQL、PZQL和空白脂质体的制备5称取LPZQ或PZQ、豆磷脂、胆固醇等膜材，有机溶媒溶解，水浴上减压蒸馏除去有机溶媒，使其成膜于瓶壁，然后加入磷酸钠缓冲溶液将膜分散，再经超声波处理，即得LPZQL或PZQL，灌封于安瓿中。同法制得空白脂质体。2.2LPZQL和PZQL的粒径分布用红细胞分析仪测定显示，LPZQL和PZQL(1)粒径大部分为24 m。1LPZQL和PZQL

10、的粒径分布Fig 1The size distribution of LPZQL and PZQL2.3扫描电镜鉴别用扫描电镜放大5 250倍，LPZQL和PZQL(2)都显示相应的脂质体为球形，并以大单层脂质体为主。2LPZQL和PZQL的扫描电镜(×5250)Fig 2Pictures on scanning electron microscope of LPZQL and PZQL(×5250)2.4包封率的测定HPLC检测条件7色谱柱ODS C18(5 m，6.0 mm×15 mm，日本)；流动相MeOH-H2O(7030)；流速0.8 ml/min；柱压

11、110 kg/cm2；柱温40；检测波长215 nm；检测最低限度2.5 ng。膜材保留时间2.540 min，内标物保留时间4.920 min；LPZQ和PZQ保留时间约5.400 min。样品处理及测定取LPZQL或PZQL 1.0 ml(含LPZQ或PZQ 5 mg)，经破坏，用氯仿提取，减压除去氯仿，再用氯仿转移至10 ml量瓶中，定容至刻度，即可测定脂质体中LPZQ或PZQ的浓度(CT)。取LPZQL或PZQL 1.0 ml(含LPZQ或PZQ 5 mg)，置微孔薄膜管中，管中嵌有0.2 m微孔薄膜，离心(1 000 r/min×12) 3 min，将膜下溶液取出，减压除去

12、溶剂，再用氯仿转移至10 ml量瓶中，定容至刻度，即可测定脂质体中游离LPZQ或PZQ的浓度(CF)。用HPLC测定LPZQ或PZQ的浓度(表1)。包封率(E%)计算式为：E(1-CF/CT)×100%。结果LPZQL和PZQL的包封率分别为98.2%和98.4%。表1HPLC测定CT和CF的结果Table 1Results of determination of CT and CF with HPLCGroupCT(mg/ml)CF(mg/ml)Encapsulation rate(%)LPZQL5.0200.08098.4PZQL4.9900.08998.22.5日本血吸虫病小鼠

13、的治疗将100只BALB/c小鼠，感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条。35 d后，按体重随机分为8组，每组910只，采用ig LPZQL25、50mg/kg二个剂量组；PZQL25、50 mg/kg二个剂量组；PZQ羧甲基纤维素钠100、200 mg/kg二个剂量组；相同体积的羧甲基纤维素钠组和脂质体组，二日疗法。治疗35 d后解剖小鼠，冲出门静脉-肠系膜静脉和肝内虫体，计数，并计算减虫率。LPZQL和PZQL抗小鼠的日本血吸虫病治疗效果比较见表2。 表2LPZQL、PZQL和PZQ抗小鼠日本血吸虫病疗效比较Table 2Comparative efficacy of LPZQL、PZ

14、QL and PZQ in experimental therapy of Schitosomiasis japomica in miceGroupsDose(mg/kg,×d)No.of miceWorms/mice±sWorm reductionrate(%)P始/末LPZQL50×210/97.60±1.5174.500.00125×210/913.38±3.6255.100.001PZQL50×210/1013.20±6.6955.700.00125×29/823.56±4.6720.9

15、00.02PZQ200×29/87.00±3.3479.100.001100×29/913.67±2.9859.200.001Liposome-9/929.78±5.07-Control-9/833.50±4.66-由表2可见，脂质体载LPZQ和PZQ抗小鼠的日本血吸虫病有效。LPZQL 50 mg/kg组减虫率高达74.5%，与LPZQL 25 mg/kg、PZQL 50 mg/kg和PZQ 100 mg/kg三个组减虫率相比，有显著的差异(P0.01)；与PZQ 200 mg/kg组减虫率相似，无显著的差异(P0.05)。LPZQ

16、L25 mg/kg、PZQL 50 mg/kg和PZQ 100 mg/kg三个组减虫率相似，无显著的差异(P0.05)。以上数据表明，LPZQL疗效较PZQ高4倍；PZQL疗效较PZQ高2倍。3讨论3.1LPZQ和PZQ均为脂溶性药物，在氯仿中易溶，在水中不溶。利用这一性质，采用逆相蒸发薄膜法制作的LPZQL和PZQL粒径大部分为24 m，主要为大单层脂质体，对LPZQ和PZQ包裹率达98%以上。3.2脂质体是一种具有类似生物膜结构的双分子小囊，其双分子层中或双分子层间可包含药物。LPZQ和PZQ可以非共价键方式被包裹于脂质体中。利用脂质体口服给药可促进LPZQ和PZQ被胃肠吸收，并保护被包裹

17、的LPZQ和PZQ不被降解，提高了LPZQ和PZQ的生物利用度。LPZQL和PZQL两种脂质体进入体内主要被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬，而治疗小鼠的日本血吸虫病。从减虫率指标显示，脂质体载LPZQ和PZQ治疗小鼠的日本血吸虫病有效。3.3在相同剂量下，LPZQL比PZQL抗小鼠的日本血吸虫病作用好，减虫率高2030%。在相似疗效(减虫率)下，LPZQL较PZQ减少4倍的剂量；LPZQL较PZQL减少1倍的剂量；PZQL较PZQ减少1倍的剂量，仍有较高疗效。这与脂质体载LPZQ和PZQ，经过肝脏，具有保护LPZQ和PZQ少发生或不发生首过效应，从而定向到达靶区，发挥其最大作用，而延缓LPZQ和P

18、ZQ的释放，使LPZQ和PZQ半衰期延长有关。据文献报道6，PZQ在血中的消除半衰期为4.8 h，而PZQL的消除半衰期为17.6 h，后者为前者的3.6倍。由于脂质体载药使血药浓度维持较高水平，让门静脉血管内的血吸虫持续接触有效的药物浓度，使低4倍剂量的LPZQL也能达到高剂量PZQ的相似疗效，从而提高了LPZQ和PZQ的生物利用度，为LPZQL和PZQL脂质体作为新剂型应用于临床提供了理论依据。希望LPZQL和PZQL脂质体能成为抗日本血吸虫病的新剂型。 作者单位：重庆医科大学药物化学与生物材料研究室，传染病寄生虫病研究所*重庆 400016参考文献1Andrews P, Thomas H, Pohlke R, et al. Praziquantel. Med Res Rev, 1983,3(2