一种从活性污泥中提取微生物总DNA的方法_图文

1、中国生物工程杂志China B i otechnol ogy, 2008, 28(7 :9799一种从活性污泥中提取微生物总DNA 的方法3郑维权春善33朴永哲王军华范圣第(大连民族学院生物技术与资源利用国家民委2教育部重点实验室大连116600摘要对活性污泥的微生物群落进行研究的首要前提是获得大量的高纯度微生物基因组DNA 。建立了一种高效、简便的提取活性污泥总DNA 方法。从提取的核酸总量、纯度、基因组完整性等多方面对所得到的DNA 质量进行了评价, 结果表明, 从单位活性污泥中提取的DNA 得率为105823g/g, 结构完整, 纯度很高, 无需进一步的纯化, 后续分子生物学操作。现在实

2、验室使用的提取活性污泥中, PCR 反应和建立文库的要求, 建立的活性污泥DNA 关键词活性污泥DNA 提取PEG 16S r 中图分类号Q523收稿日期:2008203202修回日期:20082042153辽宁省自然科学基金(202001 、大连民族学院青年基金(2007A101 资助项目33通讯作者, 电子信箱:m ikyekendlnu . edu . cn浮物质、体, 。由于污泥成分较复杂, 所处的环境较特殊, 因此微生物在种类和数量上都应比其他环境丰富, 并蕰藏着大量尚未被人类开发的功能基因。由于传统的纯培养方法很难真实、全面的反映污泥中的微生物种群结构, 因此人们对污泥中的微生物了

3、解甚少, 尤其是降解特殊化合物的微生物的了解甚少。利用分子生物学技术对污泥进行菌群动态跟踪和功能菌群鉴定, 了解细菌区系和种群数量, 认识细菌群落的稳定性和一些功能菌在有害物降解中的功能和作用, 揭示菌群结构与功能的关系, 从而可以进一步优化活性污泥法生物处理系统运行, 提高废水处理效果13。近年来, 有关从土壤、水体、海洋沉积中提取DNA 的方法已得到较好发展4, 5, 但对活性污泥总DNA 的提取方法研究较少。由于活性污泥细菌种类组成复杂且混杂有大量有毒物质, 如何使所有细胞裂解、充分释放DNA , 有效去除杂质, 得到可以进行分子生物学操作的高纯度DNA 是研究活性污泥种群结构与功能关系

4、的关键所在。将多种微生物细胞破碎方法有机结合提取活性污泥中的染色体DNA, 最终获得了高浓度和高纯度的完整染色体DNA , 并发现无需进一步纯化即可直接进行后续分子生物学操作, 为活性污泥微生物群落分析打下良好的基础。1材料与方法1. 1材料污泥提取于大连市污水处理厂和大连经济技术开发区污水处理厂的二沉池, 马栏河排污处等处, 样品依次编号为DL8、DL10、DK8、DK10、MK8、MK10。CT AB(Am resco 、PEG8000(Am resco 、裂解酶(Am resco 、ExTaq T M、Eco R I 和H in d III 来自宝生物工程(大连 有限公司, 其余化学试剂

5、均为国产。1. 2样品预处理将采集的污泥(水 迅速带回实验室, 立即离心10m in (8000×g, 4 , 弃去上层污水, 称取10g 活性污泥样品用适量的磷酸钠缓冲液(pH 8. 0 洗涤两次, 离心10m in (8000×g, 4 , 弃上清液, -70保存。1. 3活性污泥总D NA 的提取污泥中加入8m l 裂解液I (0. 15mol/LNaCl, 0. 1mol/LEDT A, 10mg/ml 裂解酶, pH 8. 0 , 37缓缓振荡12h, 然后加入8m l 裂解液II (0. 1mol/LNaCl,0. 5mol/LTris 2HCl, 10%S D

6、S, pH 8. 0 , 混匀, -80和65反复冻融3次4, 离心10m in (8000×g, 4 , 弃 中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol . 28No . 72008沉淀。上清液中依次加入2. 1m l 裂解液III (10% CT AB , 0. 7mol/LNaCl 和2. 7m l 5mol/LNaCl, 混匀, 在65水浴中放置10m in 。依次用酚氯仿异戊醇(25241 和氯仿异戊醇(241 抽提, 得到的上层水相与等体积的溶液I V (13%PEG 8000, 1. 6mol/LNaCl 混合, 冰中静置2h 。离心15m i

7、n (8000×g, 4 弃上清液, 沉淀用70%乙醇洗涤一遍, 室温干燥后溶于适量TE (10mmol/LTris 2HCl, 1mmol/LEDT A , pH 8. 0 中。加入10mol/L醋酸铵溶液, 并使醋酸铵最终浓度达到1. 5mol/L,混匀, 室温静置2h, 离心10m in (8000×g, 4 , 弃沉淀。上清液中加入2倍体积的无水乙醇, 混匀后于-20静置20m in 。沉淀用70%乙醇洗涤后, 于室温干燥, 用适量TE 溶解DNA, 加入1/3体积1mol/L氯化镁溶液, 混匀, 室温静置1h, 离心10m in (8000×g,4 ,

8、弃沉淀。上清液中加入等体积的异丙醇, 混匀后于室温静置20m in 。1. 4D NA 质量检测用Sau 3A I 照产品说明进行。为模板进行16Sr DNA 的扩增。PCR 6,并采用大连宝生物公司的Ex Taq T M试剂盒, 模板DNA 量为200ng 。2结果与讨论2. 1污泥总D NA 的提取结果取适量提取得到的污泥微生物总DNA, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1 。四种DNA 样品分子量均大于23kb, 结构完整, 未见明显降解现象。活性污泥中的腐 殖酸性质为酸性, 是影响DNA 质量的重要因素之一。碱性缓冲液的作用是充分打散活性污泥中的絮凝和去除附着于污泥表面的部分腐殖酸。PEG

9、 具有较强的亲水性, 可以与生物大分子发生共沉淀作用, 可以达到温和沉淀DNA , 且不易引起染色体DNA 变性的目的。醋酸铵可作为DNA 的松弛试剂7, 8, 当与DNA 溶液混合浓度达到0. 01mol/L,pH 为7. 2时, 可使环形DNA 充分展开。实验结果表明加入醋酸铵混匀、静置过程中, 随着核酸链的慢慢舒展, 一些包裹在DNA 中的杂质逐步脱离DNA 大分子, 最终以沉淀的形式去除。四种活性污泥总DNA 溶液均近似于无色, 其紫外检测结果如表1所示, 并与Purkhold 等9中报道过的提取方法进行了比较。由表1可知, 采用论文所描述的方法DNA 提取率很高, 并且得到的染色体D

10、NA 纯度图1从不同活性污泥提出的基因组D NA 电泳结果F i g . 1Geno m i c D NA extracti on fro md i fferen t acti va ted sludgesM:2H in d m i c D NA Extracti on提取率(g/g aABS 260n m /ABS280n m bDK8555. 0±0.0331. 90±0. 047DK83155. 4±0. 0211. 33±0. 098DL8823. 1±0. 0111. 89±0. 023DL83174. 3±0.

11、9201. 50±0. 085DK9195. 8±0. 0121. 80±0. 01833The method f or the use of Purkhold et al 9reporteda, b are the average of the results for m the chr omos omelDNA of 10gsludge extracti on by three ti m es很高, ABS 260nm /ABS280n m 处于1. 82. 0之间。2. 216S rRNA 扩增检测采用细菌16S r RNA 通用引物进行PCR 扩增检测。扩

12、增后的PCR 产物条带清晰, 浓度较高, 无非特异性带(图2 。表明提取得到的活性污泥总DNA 纯度高, 可以直接用于PCR 扩增。图216S r D NA 的PCR 扩增结果F i g . 2Result of 16S r D NA PCR productby agarose electrophoresisM:DL 22000Marker; 1:Amphificati on of Genome DK8; 2:Amp lifeati on of Genome DK9; 3:Restricti on of GenomeMK8; 4:Restricti on of Genome MK989 200

13、8, 28(7郑维等:一种从活性污泥中提取微生物总DNA 的方法2. 3限制性内切酶消化实验结果在酶切反应液20l 反应体系中, 大部分染色体DNA 在3m in 内被Sau3A I 消化(图3 , 说明此方法提取得到的染色体DNA 质量较高, 可以用于多态性分析及构建宏基因组文库。 图3限制酶消化四种活性污泥基因组D NA 的电泳结果F i g . 3Restr i cti on of Geno m i c D NA fro m four k i n d of acti va ted M:2Hind III Marker ; 1:DL8; on of Ger o me DL9; 3:Rest

14、ricti on DK 8; on of Geno me DK 93结论建立了一种高效、简便的提取活性污泥总DNA 方法, 提取得到的DNA 纯度很高, 结构完整, 无需进一步的纯化, 即可直接进行微生物群落分析及构建文库等后续分子遗传学操作。因为可以避免纯化过程中带来的DNA 损失, 可近一步保证微生物群落的完整性。参考文献1Hessel m ann R P, W erlen C, Hahn D, et al . Enrichment,phyl ogenetic analysis and detecti on of a bacterium that perf or m s enhanced

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16、s in an enhanced bi ol ogical phos phorus removal p r ocess . W ater Sci Technol, 1998, 37(6 :4814843Coskuner G, Curtis T P . I n suit characterizati on of nitrifies inan activated sludge p lant:Detecti on of N itr obacteria . J App l M icr obi ol ogy, 2002, 93(3 :4314374Tsai Y L, O ls on B H. Rap i

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20、 2000, 66:53685382The Extracti on M ethod of Bacter i a l D NA fro m Acti va ted SludgesZHENG W ei QUAN Chun 2shan P I A O Yong 2zhe WANG Jun 2hua F AN Sheng 2di(Dalian Nati onalities University, Key Laborat ory of B i otechnol ogy &B i o 2Res ources U tilizati on,State Ethnic Affairs Comm issi

21、on and M inistry of Educati on, Dalian 116600, China Abstract Methods for studying the populati on diversity of m icr oorganis m in activated sludge usually require enrich ment of bacterial genome . The efficient inf or mati on on m icr obial s pecies compositi on p r ovided and shifted in diversity revealed are dependent on the effective DNA recovery technique . The method was based on washing by alkaline phos phate buffer and digesti on with ex