第6章植物原生质体培养与体细胞杂交

1、第六章第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交植物原生质体培养与体细胞杂交 第一节第一节 原生质体的分离和纯化原生质体的分离和纯化 第二节第二节 原生质体培养原生质体培养 第二节第二节 植物体细胞杂交植物体细胞杂交一、植物原生质体的概念一、植物原生质体的概念二、原生质体的分离二、原生质体的分离三、原生质体的纯化三、原生质体的纯化四、原生质体的活力测定四、原生质体的活力测定五、影响原生质体数量和活力的因素五、影响原生质体数量和活力的因素第一节第一节 原生质体的分离和纯化原生质体的分离和纯化一、植物原生质体的概念一、植物原生质体的概念18801880年，年，HansteinHanstein：质壁分离时

2、，能够与细胞：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。壁分开的那部分细胞物质。原生质体原生质体(protoplast)(protoplast) ：去掉细胞壁的细胞或：去掉细胞壁的细胞或是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。亚原生质体亚原生质体(subprotoplast)(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体核质体(nuclearplast)(nuc

3、learplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。胞核形成的小原生质体。 胞质体胞质体（cytoplastcytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。的原生质体。二、原生质体的分离二、原生质体的分离1.1.机械法机械法2.2.酶解法酶解法1.1.机械法分离原生质体机械法分离原生质体 借助利器（如刀等）或机借助利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁破损，械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。促使原生质体释放的方法。机械法分离原生质体的主要特点：机械法分离原生质体的主要特点：l产量低；产量低

4、；l高度液泡化的贮藏组织；高度液泡化的贮藏组织；l排除外加酶的有害影响。排除外加酶的有害影响。2. 2. 酶解法分离原生质体酶解法分离原生质体 借助酶解液的作用降解细胞壁，获得大量有活力的原生借助酶解液的作用降解细胞壁，获得大量有活力的原生质体的方法。质体的方法。 主要特点：主要特点： （1 1）产量高，适用范围广；）产量高，适用范围广； （2 2）对活细胞的损伤较轻；）对活细胞的损伤较轻； （3 3）原生质体可能会受到酶的某些不利影响。）原生质体可能会受到酶的某些不利影响。（1）材料选择）材料选择选择依据：选择依据：具有良好的形态发生潜力；具有良好的形态发生潜力；量大、质地均一；量大、质地均

5、一；经酶解后原生质体稳定性好、活性高。经酶解后原生质体稳定性好、活性高。常用材料：常用材料： 幼叶、胚轴、子叶、茎、叶；幼叶、胚轴、子叶、茎、叶； 愈伤组织、胚状体和悬浮细胞。愈伤组织、胚状体和悬浮细胞。（2 2）材料预处理）材料预处理 目的：目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效率，提高原生质体的活力和分裂频率。率，提高原生质体的活力和分裂频率。方法：方法： 低温处理、低温处理、 暗处理、暗处理、 预培养等。预培养等。（3 3）酶解）酶解分离原生质体的酶类分离原生质体的酶类l纤维素酶纤维素酶l半纤维素酶半纤维素酶l果胶酶果胶酶l胼胝质酶胼胝质酶l蜗

6、牛酶蜗牛酶纤维素酶：纤维素酶： 从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂。作用是降解从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂。作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体纤维素，得到裸露的原生质体 。 如：如： Cellulase Onozuka R-10Cellulase Onozuka R-10（JapanJapan） Cellulase Onozuka RS Cellulase Onozuka RS （JapanJapan） CellulysinCellulysin（USAUSA） 纤维素酶纤维素酶EA-867EA-867（上海植生所）（上海植生所）果胶酶果胶酶/ /离析酶：离析酶： 是从根霉或曲霉中提取出来的

7、，使细胞间是从根霉或曲霉中提取出来的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从植物组织中单独释放出的果胶质降解，把细胞从植物组织中单独释放出来。来。 如：如： Macerozyme R-10Macerozyme R-10（JapanJapan） PectinasePectinase（USAUSA） Pectolyase Y-23Pectolyase Y-23（JapanJapan）半纤维素酶：半纤维素酶： 主要由曲霉中提取，专门分解主要由曲霉中提取，专门分解半纤维素半纤维素。从愈伤组织分。从愈伤组织分离原生质体时，有时增加半纤维素酶。离原生质体时，有时增加半纤维素酶。 如：如：Rhozyme HP-15

8、0Rhozyme HP-150（USAUSA）、）、HemicellulaseHemicellulase（USAUSA）胼胝质酶：胼胝质酶： 主要用于分离主要用于分离花粉小孢子花粉小孢子的原生质体。的原生质体。蜗牛酶：蜗牛酶： 从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢粉素、木质素有一定的分解能力，用于粉素、木质素有一定的分解能力，用于分离花粉母细胞分离花粉母细胞、四分体细胞四分体细胞或从或从较老的组织较老的组织分离原生质体。分离原生质体。崩溃酶：崩溃酶： 是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果胶酶等多种酶的活是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果

9、胶酶等多种酶的活性，在与果胶酶混合使用时，对分离性，在与果胶酶混合使用时，对分离培养细胞及根尖细胞培养细胞及根尖细胞有加速解离的效果。有加速解离的效果。 酶溶剂及其渗透压酶溶剂及其渗透压酶溶剂酶溶剂：原生质体培养基：原生质体培养基 渗透压调节剂渗透压调节剂： 作用：作用：代替细胞壁对原生质体起保护作用。代替细胞壁对原生质体起保护作用。 糖醇类糖醇类：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 使用浓度：使用浓度：0.20.20.8mol/L0.8mol/L质膜稳定剂：质膜稳定剂： 溶液中加入一些溶液中加入一些盐类盐类，可以保护细胞膜、提高，可以保护细胞膜、提高原生质体稳

10、定性和活力。原生质体稳定性和活力。常用的有：常用的有：CaCl2CaCl2（0.70.71.0mol/L1.0mol/L）、）、KH2PO4KH2PO4、KClKCl、MgSO47H2OMgSO47H2O、MESMES（2-2-氮吗啉乙烷磺酸）氮吗啉乙烷磺酸）和葡聚糖硫酸钾等。和葡聚糖硫酸钾等。酶液的配制酶液的配制： 按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种稳定剂稳定剂, ,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶液用孔径为液用孔径为0.45m0.45m的微孔滤膜的微孔滤膜过滤灭菌过滤灭菌后备用。后备用。酶液的酶液的pHp

11、H值：值： 分离原生质体时一般将酶液的分离原生质体时一般将酶液的pHpH调节在调节在5 56 6之之间。间。 酶液的配制及酶液的配制及pHpH值值 酶浓度和酶解时间酶浓度和酶解时间酶浓度：酶浓度： 纤维素酶：一般为纤维素酶：一般为0.50.55 5 果胶酶：一般为果胶酶：一般为0.10.11 1 蜗牛酶和胼胝质酶：一般为蜗牛酶和胼胝质酶：一般为0.50.52.02.0酶解时间：酶解时间：30min30min20h20h，一般，一般2424小时。小时。温度：温度：一般在一般在25-2825-28，兼顾原生质体及酶活性。兼顾原生质体及酶活性。酶解过程酶解过程：一般是在：一般是在黑暗、静止黑暗、静止

12、条件下进行。条件下进行。酶量：酶量：材料和酶量的比例一般为材料和酶量的比例一般为1g1g：10ml10ml。一些作物所用的酶解液一些作物所用的酶解液材料材料CaCl2H2O(mg/L)KH2PO4(mg/L)MES(mg/L)纤维素纤维素酶酶%果胶果胶酶酶%离析离析酶酶%半纤半纤维素维素酶酶%甘露醇甘露醇（mol/L）pH小麦悬小麦悬浮细胞浮细胞147095600RS 2.0Y-23 0.20.555.6水稻悬水稻悬浮细胞浮细胞147095600R-10 0.1、RS 0.5Y-23 0.11.00.405.6玉米悬玉米悬浮细胞浮细胞147095600RS 3.0Y-23 0.10.50.50

13、.505.6两步法两步法：先用果胶酶离析植物组织后收：先用果胶酶离析植物组织后收集植物细胞，洗涤后用纤维素酶解离细集植物细胞，洗涤后用纤维素酶解离细胞壁。胞壁。一步法一步法：把一定量纤维素酶和果胶酶组：把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液成混合酶液, ,对材料进行一次性处理。对材料进行一次性处理。 酶解方法酶解方法三、原生质体的纯化三、原生质体的纯化 纯化的含义：纯化的含义： 一是从酶混合液中收集到的原生质体一是从酶混合液中收集到的原生质体, ,在培养前在培养前必须把必须把酶液冲洗干净酶液冲洗干净；二是；二是得到纯净的原生质体得到纯净的原生质体。 纯化原生质体的方法纯化原生质体的方法 1.1.

14、飘浮法飘浮法 2.2.沉淀法沉淀法 3.3.界面法界面法 1.飘浮法飘浮法原理：原理：利用原生质体和其他组分密度的不同，酶利用原生质体和其他组分密度的不同，酶解处理中使用解处理中使用相对分子质量较大相对分子质量较大的物质（蔗糖、的物质（蔗糖、葡聚糖），离心后使原生质体漂浮在溶液表面，葡聚糖），离心后使原生质体漂浮在溶液表面，细胞碎片等杂质下沉到管底的方法。细胞碎片等杂质下沉到管底的方法。 特点：特点：操作简单，但数量上损失较多。操作简单，但数量上损失较多。2.沉淀法沉淀法原理：原理：酶解处理中使用酶解处理中使用相对分子质量较小相对分子质量较小的物的物质（甘露醇），质（甘露醇），原生质体的比重大

15、于溶液时原生质体的比重大于溶液时，在低速下离心后原生质体沉到管底在低速下离心后原生质体沉到管底, ,其余细胞碎其余细胞碎片等物多数漂浮在溶液中。片等物多数漂浮在溶液中。特点：特点：简单方便，简单方便，丢失少，丢失少，但纯度不够高。但纯度不够高。3.界面法（梯度离心法）界面法（梯度离心法）原理：原理：选选两种不同渗透浓度的溶液两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，经离心后使完整无损的原生质体处于度，经离心后使完整无损的原生质体处于两种溶液的界面两种溶液的界面之间之间

16、，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质体可在这两相系统的界面上收集到。体可在这两相系统的界面上收集到。特点：特点：可以收集大量、纯净的原生质体，同时避免收集过程可以收集大量、纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互积压而破碎。中原生质体因相互积压而破碎。常用系统常用系统：PEGPEG（60006000）-Ficoll-Ficoll（4000040000）系统，）系统， 甘露醇（甘露醇（182.17 ）-Ficoll-Ficoll系统，系统， 蔗糖（蔗糖（342.3 ）- -甘露醇系统等。甘露醇系统等。25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液纯

17、化后的原生质体纯化后的原生质体四、原生质体的活力测定四、原生质体的活力测定原生质体活力原生质体活力 有活力原生质体数有活力原生质体数 观察原生质体数观察原生质体数1001.1.形态识别形态识别：形态完整，富含细胞质，颜色新鲜，正常球形 。2.2.相差显微镜观察法相差显微镜观察法：观察细胞质环流、核的正常与否。3.3.酚藏花红染色法（酚藏花红染色法（0.1%) 0.1%) ：有活力原生质体不被染色，而无活力的被染成红色 。4.4.伊凡蓝染色法伊凡蓝染色法(0.025%) (0.025%) ：活力受损或死细胞才能摄取这种染料，活细胞不摄取。5.5.荧光素双醋酸酯染色法（荧光素双醋酸酯染色法（0.0

18、1%0.01%）：）： 即FDA法， FDA能自由穿越完整细胞质膜，一旦进入原生质体后受酯酶裂解形成有极性的物质荧光素，在紫外光照射下产生绿色荧光。 造粉体 五、影响原生质体数量和活力的因素五、影响原生质体数量和活力的因素q植物材料的类型及生理状态植物材料的类型及生理状态 q酶的种类、浓度、组合及酶解时间、酶解方式等酶的种类、浓度、组合及酶解时间、酶解方式等q渗透压稳定剂渗透压稳定剂q质膜稳定剂质膜稳定剂q温度、光照及温度、光照及pHpH第二节第二节 原生质体培养原生质体培养一、一、原生质体培养的意义原生质体培养的意义 1.1.建立单细胞无性系建立单细胞无性系 2.2.为细胞融合奠定基础为细胞

19、融合奠定基础 3.3.遗传工程的理想受体遗传工程的理想受体 4.4.原生质体是多种基础理论研究的实验系统原生质体是多种基础理论研究的实验系统1. 1. 培养基培养基（1 1）渗透压：）渗透压：与细胞渗透压与细胞渗透压等渗等渗或或稍稍低低。渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖等。和葡萄糖等。当原生质体再生细胞壁并开始分裂后当原生质体再生细胞壁并开始分裂后, ,必须必须逐步逐步降低渗透压降低渗透压, ,直到与细胞培养基同样的水平。直到与细胞培养基同样的水平。二、原生质体培养二、原生质体培养（2 2）无机盐）无机盐: :大量元素：一般较愈伤组织

20、培养中的浓度低大量元素：一般较愈伤组织培养中的浓度低NO3- / NH4+NO3- / NH4+的比例高的比例高 Ca+ Ca+ 、Mg+Mg+需求高需求高 （3 3）有机成分）有机成分：种类齐全 （4 4）激素）激素：生长素与细胞分裂素对诱导细胞壁的形成和细胞分裂、分化是必需的。 （5 5）pHpH值及灭菌：值及灭菌：一般pH值以5.6-6.0为宜，过滤灭菌。2. 原生质体培养方法原生质体培养方法 饲养层培养饲养层培养方法一方法一：X-X-射线杀死射线杀死原生质体，与生活力原生质体，与生活力正常的原生质体混合，正常的原生质体混合，加入加入0.6%0.6%琼脂，制成琼脂，制成混合液，培养于培养

21、混合液，培养于培养皿中。皿中。方法二方法二：X-X-射线杀死原生射线杀死原生质体，与质体，与0.6%0.6%琼脂混合，琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正为饲养层，再将生活力正常的原生质体与常的原生质体与0.6%0.6%琼脂琼脂混合，培养于饲养层上。混合，培养于饲养层上。3.3.培养条件培养条件n光照光照：新分离处理来的原生质体应在散射光新分离处理来的原生质体应在散射光下或黑暗中培养。下或黑暗中培养。n温度温度：一般一般25253030。n湿度：湿度：100%100%。4、原生质体发育和植株再生、原生质体发育和植株再生 第一次分裂第一次分裂再生细胞壁再生

22、细胞壁荧光增白剂荧光增白剂（卡氏白（卡氏白)圆变为圆变为椭圆形椭圆形第二次分裂第二次分裂第第N次分裂次分裂小细胞团小细胞团肉眼可见的细胞团肉眼可见的细胞团愈伤组织愈伤组织植株再生植株再生23周，植板率周，植板率10h以上以上诱导器官发生诱导器官发生诱导形成胚状体诱导形成胚状体5. 5. 原生质体培养过程中的管理原生质体培养过程中的管理及时及时添加添加新鲜培养基新鲜培养基逐步逐步降低降低培养基的渗透压培养基的渗透压及时及时调整调整培养基中的激素成份培养基中的激素成份烟草叶肉原生质体培养中液体培养中渗透压的改变步骤烟草叶肉原生质体培养中液体培养中渗透压的改变步骤 原生质体培养在原生质体培养在8ml

23、内含内含9%甘露醇甘露醇的培养基中的培养基中2周周加入加入2ml内含内含6%甘露醇甘露醇的培养基的培养基2周周加入加入2ml内含内含3%甘露醇甘露醇的培养基的培养基2周周加入加入2ml无甘露醇无甘露醇的培养基的培养基2周周将形成的较大的将形成的较大的细胞团细胞团或或愈伤组织愈伤组织转移到转移到固体固体培养基培养基(内含内含2.0mg/L IAA和和1mg/L 6-BA)上培养促进芽的形成上培养促进芽的形成2周周转移到转移到MS基本培养基上促进苗产生根基本培养基上促进苗产生根,最后长成完整植株最后长成完整植株例：例：四、影响原生质体培养的主要因素四、影响原生质体培养的主要因素 1 1、原生质体的

24、活力、原生质体的活力2 2、原生质体的起始密度、原生质体的起始密度3 3、原生质体的营养和环境、原生质体的营养和环境4 4、基因型、基因型1. 1. 原生质体的活力原生质体的活力q细胞壁降解酶的种类和组合细胞壁降解酶的种类和组合q渗透压稳定剂渗透压稳定剂q质膜稳定剂质膜稳定剂q温度因子的影响温度因子的影响q植物材料的类型及生理状态植物材料的类型及生理状态 密度过密度过高高时，有可能造成培养物营养不足或细胞时，有可能造成培养物营养不足或细胞代谢产物过多而妨碍再生细胞的正常生长代谢产物过多而妨碍再生细胞的正常生长密度过密度过低低时，再生细胞不能进行持续分裂时，再生细胞不能进行持续分裂 一般原生质体

25、培养时，一般原生质体培养时，起始密度起始密度为为10104 4-10-105 5个个/ml/ml，低密度下低密度下的培养使用较复杂的培养基和特殊的培养使用较复杂的培养基和特殊的培养方法。的培养方法。2. 2. 原生质体的起始密度原生质体的起始密度3. 3. 原生质体的营养和环境条件原生质体的营养和环境条件光照：原生质体分裂诱导不需要光，光照：原生质体分裂诱导不需要光，暗培养暗培养温度：温度：25253030湿度：湿度：100100培培 养养 基基环境条件环境条件硝酸盐和铵盐比例硝酸盐和铵盐比例高高与原生质体质膜稳定有利的物质与原生质体质膜稳定有利的物质用量比较用量比较高高。如。如CaClCaC

26、l2 2、KHKH2 2POPO4 4渗透压的特点：渗透压的特点：含有含有高高浓度的甘露醇，或浓度的甘露醇，或以葡萄糖和蔗糖代替甘露醇。应根据原生以葡萄糖和蔗糖代替甘露醇。应根据原生质体再生细胞的发育状态和需要质体再生细胞的发育状态和需要, ,调节调节各发各发育时期的营养和碳源的成份。育时期的营养和碳源的成份。 4. 4. 基因型基因型 植物形态发生受基因控制的，是一个复植物形态发生受基因控制的，是一个复杂的过程，不同基因型的原生质体的形态发杂的过程，不同基因型的原生质体的形态发生能力不同。而且原生质体的不同生长发育生能力不同。而且原生质体的不同生长发育时期受不同基因所控制。时期受不同基因所控

27、制。第三节、植物体细胞杂交第三节、植物体细胞杂交一、植物体细胞杂交的意义一、植物体细胞杂交的意义二、原生质体诱导融合的方法和融合类型二、原生质体诱导融合的方法和融合类型三、杂种细胞的选择系统三、杂种细胞的选择系统四、体细胞杂种植株的鉴定四、体细胞杂种植株的鉴定五、杂种细胞的发育及其特性五、杂种细胞的发育及其特性体细胞杂交（体细胞杂交（somatic hybridizationsomatic hybridization）/ /原生质体融合原生质体融合(protoplast fusion)(protoplast fusion)： 指把两种指把两种不同种不同种或或不同属不同属、不同科不同科生物的细胞

28、的原生质生物的细胞的原生质体分别分离出来体分别分离出来, ,再用一定的技术而发生膜融合、胞质融合再用一定的技术而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成和核融合并形成杂种细胞杂种细胞，进一步发育成完整植物体。也称，进一步发育成完整植物体。也称为为细胞融合。细胞融合。一、体细胞杂交的意义一、体细胞杂交的意义突破物种间生殖隔离，创造新物种突破物种间生殖隔离，创造新物种培育作物新种质和新品种培育作物新种质和新品种细胞质杂种的获得细胞质杂种的获得细胞膜和细胞器行为的研究、细胞器的互作研究细胞膜和细胞器行为的研究、细胞器的互作研究染色体行为的研究染色体行为的研究 19601960年：年：酶法分离原生质体酶法分

29、离原生质体的诞生，打开了利用的诞生，打开了利用原生质体作为实验材料的许多重要研究领域。原生质体作为实验材料的许多重要研究领域。 19701970年：年：PowerPower首次用首次用硝酸钠硝酸钠做诱变剂，可使燕做诱变剂，可使燕麦、玉米等根原生质体有较大量的融合。麦、玉米等根原生质体有较大量的融合。 19721972年：年：CarlsonCarlson等获得第一个等获得第一个种间种间植物细胞杂植物细胞杂种（粉蓝烟草和郎氏烟草）。种（粉蓝烟草和郎氏烟草）。 19741974年：年：KaoKao等建立了等建立了聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）诱导植物诱导植物细胞融合的技术。细胞融合的技术。 19

30、781978年：年：MelcherMelcher等获得了第一个等获得了第一个属间属间细胞杂种（番茄细胞杂种（番茄+ +和和马铃薯）。马铃薯）。 19811981年：年：ZimmermanZimmerman等发明了等发明了电融合仪电融合仪，并首次提出了，并首次提出了电融电融合合概念。概念。 19901990年：来源于体细胞杂交的第一个商品化的烟草栽培品年：来源于体细胞杂交的第一个商品化的烟草栽培品种释放。种释放。 19951995年：获得第一个烟草年：获得第一个烟草- -老鼠杂种植物。老鼠杂种植物。 目前：目前：很多研究都集中在一些细胞组织培养技术很多研究都集中在一些细胞组织培养技术已比较成熟的

31、植物种属已比较成熟的植物种属, ,如如烟草属烟草属, ,茄属茄属等中等中, ,主要研主要研究方面是在种间杂种中究方面是在种间杂种中转移个别染色体转移个别染色体或或基因基因，或通，或通过胞质杂种获得过胞质杂种获得中间材料中间材料, ,以供育种应用。以供育种应用。自发融合（自发融合（spontaneous fusionspontaneous fusion）： 去壁后的去壁后的同种同种原生质体之间常发生融合形成原生质体之间常发生融合形成同核体同核体（homokaryonhomokaryon），频率一般在，频率一般在8 830%30%之间。它是由之间。它是由于不同细胞间胞间连四的扩展和粘联造成的，不属

32、于不同细胞间胞间连四的扩展和粘联造成的，不属于细胞杂交的范畴。于细胞杂交的范畴。 诱导融合（诱导融合（induced fusioninduced fusion） ： 通过人工诱导的方式，使通过人工诱导的方式，使不同来源不同来源的原生质体之间的原生质体之间发生融合，形成发生融合，形成异核体（异核体（heterokaryonheterokaryon）。 二、原生质体诱导融合的方法和类型二、原生质体诱导融合的方法和类型诱导融合诱导融合对称融合对称融合非对称融合非对称融合融合产物融合产物同核体同核体异核体异核体细胞质杂种细胞质杂种同核体：同核体：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞。基因型相同的细胞融合成

33、的杂交细胞。异核体：异核体：基因型不同的细胞融合成的杂交细胞。基因型不同的细胞融合成的杂交细胞。细胞质杂种：细胞质杂种：只含有亲本一方的核基因组，而含有亲只含有亲本一方的核基因组，而含有亲本双方的细胞质基因的细胞杂种。本双方的细胞质基因的细胞杂种。杂种细胞：杂种细胞：由不同来源的原生质体经诱导由不同来源的原生质体经诱导融合后形成融合后形成的细胞的细胞。细胞杂种：细胞杂种：由不同来源的原生质体融合形成的杂种细由不同来源的原生质体融合形成的杂种细胞经培养后再生出的胞经培养后再生出的杂种植株杂种植株。（一）、诱导原生质体融合的方法（一）、诱导原生质体融合的方法1 1、化学融合、化学融合 （1 1）N

34、aNO3NaNO3融合融合 （2 2）高）高Ca2+Ca2+和高和高PHPH值诱导融合值诱导融合 （3 3）PEGPEG（聚乙二醇）诱导融合（聚乙二醇）诱导融合 （4 4）PEG-PEG-高高Ca2+Ca2+和高和高PHPH值诱导融合值诱导融合2 2、物理融合：电融合、物理融合：电融合1. 1. 化学融合化学融合（1 1）NaNO3NaNO3融合：融合率融合：融合率0.10.14 4 方法：方法：5.55.5NaNO3 + 10NaNO3 + 10蔗糖，在蔗糖，在35 5min -35 5min -离心离心-30 -30 30min30min，清洗培养。，清洗培养。机理机理：NaNa等离子能中

35、和原生质体表面的负电荷，使凝聚的等离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合。原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合。特点特点：对原生质体的破坏小，但异核体形成的频率不高，对原生质体的破坏小，但异核体形成的频率不高，尤其对高度液泡化的叶肉原生质体不易诱发融合。因此目尤其对高度液泡化的叶肉原生质体不易诱发融合。因此目前几乎不再使用。前几乎不再使用。机理：机理：高高PH-PH-高的浓度高的浓度Ca2 +Ca2 +离子能中和质膜正常的表离子能中和质膜正常的表面电荷，可使凝聚的原生质膜紧密接触，一定的高温面电荷，可使凝聚的原生质膜紧密接触，一定的高温可促进膜的融合。可促进膜

36、的融合。特点：特点：融合产量高，但融合产量高，但高高pHpH值对细胞有毒害作用。值对细胞有毒害作用。（2 2）高）高Ca2 +Ca2 +和高和高PHPH值诱导融合值诱导融合：融合率：融合率1010 （3 3） PEGPEG（聚乙二醇）诱导融合（聚乙二醇）诱导融合19741974年：年：Kao Kao 和和MichaylukMichayluk采用此法大大提高了异核体的融采用此法大大提高了异核体的融合频率，重复性强。合频率，重复性强。 方法：方法：将原生质体混合液用将原生质体混合液用28285858的的PEGPEG（相对分子质量（相对分子质量1500150060006000）溶液处理）溶液处理15

37、1530min30min，清洗后培养。，清洗后培养。特点：特点：双核异核体形成频率高，重复性好，双核异核体形成频率高，重复性好，PEGPEG诱导无物种诱导无物种特异性。特异性。（4 4） PEG-PEG-高高pH-pH-高高Ga2+Ga2+诱导融合诱导融合n19761976年：年：KaoKao发现用高发现用高pHpH和高和高CaCa结合结合PEGPEG融融合频率更高。用高钙强碱溶液代替培养基合频率更高。用高钙强碱溶液代替培养基清洗清洗PEGPEG。nPEGPEG和高和高Ca+Ca+、高、高PHPH值对融合起到了值对融合起到了协同协同作作用，用，PEGPEG直接或间接通过直接或间接通过Ca+Ca

38、+起作用。起作用。n诱导率：诱导率：40405050以上。以上。PEGPEG的作用机理：的作用机理： PEGPEG分子具有轻微的分子具有轻微的负极性负极性，可以与具有正极性基团，可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成的水、蛋白质和碳水化合物等形成H H键，从而在原生质体键，从而在原生质体之间形成之间形成分子桥分子桥，其结果使，其结果使原生质体发生粘连原生质体发生粘连。 在洗脱过程中，在洗脱过程中，PEGPEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位

39、与另一原生质体的正性电荷个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。部位相连而导致融合。优点优点：q融合融合成本低成本低，勿需特殊设备；，勿需特殊设备；q异核率较高，异核率较高，可重复性强可重复性强；qPEGPEG诱导的融合过程诱导的融合过程不受物种限制；不受物种限制；q毒性低。毒性低。缺点：缺点：q融合过程繁琐；融合过程繁琐；q一些植物种原生质体质膜性质强弱不一一些植物种原生质体质膜性质强弱不一, ,常出现对常出现对PEGPEG敏感敏感, ,而破碎的现象；而破碎的现象；qPEGPEG的分子量大小的分子量大小, ,浓度高低的使用不当也可影响浓度高低的使用不当也可影响融合

40、的效果。融合的效果。PEGPEG诱导融合的特点诱导融合的特点 化学融合的过程化学融合的过程：聚集阶段，原生质体膜彼此靠近；聚集阶段，原生质体膜彼此靠近；局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在2 2个原个原生质体间细胞质呈连续状态；生质体间细胞质呈连续状态；细胞质扩散，融合完成，形成异核体。细胞质扩散，融合完成，形成异核体。 电融合：电融合：指利用改变电场来诱导原生质体彼此连接指利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿可逆性电击穿，促使原生质体融合的方法。促使原生质体融合的方法。2 2电融合法电融

41、合法（1 1）电融原理：）电融原理：q当原生质体处于当原生质体处于电导率很低电导率很低的溶液中时，通电后电流的溶液中时，通电后电流即通过原生质体，在非均匀的即通过原生质体，在非均匀的交变电场交变电场中时，发生双中时，发生双向电泳而进入电场反应强的区域，同时，原生质体在向电泳而进入电场反应强的区域，同时，原生质体在电场作用下，发生极化而产生偶极子，使原生质体沿电场作用下，发生极化而产生偶极子，使原生质体沿电场线运动，细胞紧密接触电场线运动，细胞紧密接触排列成串排列成串；然后给予短暂；然后给予短暂的的高压脉冲高压脉冲，导致接触面的细胞膜，导致接触面的细胞膜击穿击穿，随后紧密接，随后紧密接触的细胞膜

42、发生触的细胞膜发生结合结合，导致细胞融合。，导致细胞融合。q为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。加上脉冲电流使原生质体局部破裂后融合，形成杂种细胞加上脉冲电流使原生质体局部破裂后融合，形成杂种细胞（2 2）电融合的优点）电融合的优点：不存在对原生质体的毒害问题；不存在对原生质体的毒害问题；融合效率高，重复性好，融合率达融合效率高，重复性好，融合率达6060以上；以上；融合技术操作简便，对融合原生质体数易于控制融合技术操作简便，对融合原生质体数易于控制等。等。影响原生质体融合的因素影响原生质体融合的因素 植物原生质体融合无种属特异性无种属特异性

43、，其融合效率仅与外界条件外界条件有关，而与其自身种属无关。q原生质体质量、密度原生质体质量、密度q融合方法融合方法qPEGPEG的规格和纯度、作用时间的规格和纯度、作用时间q电融合参数电融合参数q融合液：融合液：少量CaCl2，既可维持一定电导率，又对细胞有保护作用 根据根据融合时细胞的完整程度融合时细胞的完整程度，可分为以下，可分为以下两种融合类型：两种融合类型：1. 对称融合（对称融合（symmetric fusion）2. 非对称融合（非对称融合（asymmetric fusion）（二）原生质体融合的类型（二）原生质体融合的类型1. 对称融合对称融合（symmetric fusion）

44、：）： 即即两个完整两个完整的细胞原生质体融合，父母本均未处理，的细胞原生质体融合，父母本均未处理，对后代贡献一样。对后代贡献一样。 对称融合常会产生对称融合常会产生对称杂种对称杂种或或不对称杂种。不对称杂种。（2 2）非对称融合）非对称融合（asymmetric fusion）：）： 一方亲本的一方亲本的全部原生质体全部原生质体与另一亲本的与另一亲本的部分核物部分核物质及胞质物质质及胞质物质重组，形成重组，形成不对称杂种不对称杂种。 利用物理或化学方法使某利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活亲本的核或细胞质失活后再进行融合。后再进行融合。核失活方法：射线，碘乙酰胺（核失活方法：射线，碘

45、乙酰胺（IOA），碘乙酸），碘乙酸质失活方法：罗丹明（质失活方法：罗丹明（R-6-G）非对称融合中非对称融合中依父母本在后代中贡献不同，它可以依父母本在后代中贡献不同，它可以分为几种：分为几种： A完整细胞+B细胞核 A完整细胞+B细胞质 A完整细胞+B细胞质和部分核物质 A细胞核+B细胞质 （三）细胞质杂种（三）细胞质杂种（cybrid）细胞质杂种：细胞质杂种：指具有一个亲本的核，而细胞质为指具有一个亲本的核，而细胞质为杂合或另一亲本的体细胞杂种。杂合或另一亲本的体细胞杂种。由以下途径产生由以下途径产生：p对称融合：对称融合：融合后的某一阶段一个亲本的核或染色体融合后的某一阶段一个亲本的核或染色体被排除。被排除。p不对称融合：不对称融合：使一个亲本的核失活或去核。使一个亲本的核失活